鋅-鎘超積累植物東南景天(Sedum alfredii Hance)兩個(gè)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的功能研究.pdf

1、探明超積累植物對(duì)重金屬超積累作用的生理生化過(guò)程和分子機(jī)理，不僅有利于植物修復(fù)技術(shù)的發(fā)展和推廣應(yīng)用，而且有助于豐富植物營(yíng)養(yǎng)學(xué)理論，是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。超積累生態(tài)型東南景天（Sedum alfredii Hance）是我國(guó)原生的鋅/鎘超積累植物，對(duì)鋅、鎘具有很強(qiáng)的耐性和很高的積累量，對(duì)其超積累作用的分子機(jī)理研究，有望克隆具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的超積累作用相關(guān)基因。
　　轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一類(lèi)位于膜上的運(yùn)輸?shù)鞍?，廣泛參與金屬元素的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和區(qū)隔過(guò)

2、程。其中鋅鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白((Z)RT,(I)RT-like(P)rotein，ZIP)廣泛存在于細(xì)菌、真菌、動(dòng)物、植物真核生物中，被認(rèn)為在鋅、鐵、錳、鎘、銅等金屬元素的根系吸收、木質(zhì)部長(zhǎng)距離運(yùn)輸以及地上部穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮重要功能。
　　基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，本實(shí)驗(yàn)室已克隆得到多個(gè)超積累生態(tài)型東南景天的ZIP家族基因，但其功能尚不明晰。在上述基礎(chǔ)上，本論文利用酵母功能互補(bǔ)、洋蔥表皮定位、q-RT-PCR、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等分子生物學(xué)方法，系統(tǒng)探究

3、了超積累東南景天中SaZIP2和SaZIP3基因的功能，取得的主要研究結(jié)果如下:
　　1、使用醋酸鋰酵母轉(zhuǎn)化法，選用野生型DY1457和DY4743、鋅鎘敏感型突變體△zrc1、鋅吸收缺陷型突變體ZHY3、錳吸收缺陷型突變體△smf1、鐵吸收缺陷型突變體DDY4分別研究SaZIP2和SaZIP3基因?qū)︽k、鋅、錳、鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。轉(zhuǎn)化SaZIP2和SaZIP3均使鋅鎘敏感型突變體△zrc1無(wú)法在含鎘培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而對(duì)酵母鎘積累量沒(méi)有影

4、響，說(shuō)明SaZIP2和SaZIP3在質(zhì)膜而非液泡膜上轉(zhuǎn)運(yùn)鎘;轉(zhuǎn)化SaZIP2和SaZIP均能恢復(fù)鋅吸收缺陷型突變體ZHY3吸收鋅的能力，且轉(zhuǎn)化SaZIP2和SaZIP3后，突變體鋅含量分別提高了63.7％和251.4％，說(shuō)明SaZIP2和SaZIP3均能轉(zhuǎn)運(yùn)鋅，且SaZIP3轉(zhuǎn)運(yùn)鋅的能力大于SaZIP2;轉(zhuǎn)化SaZIP3的錳吸收缺陷型突變體△smf1錳含量較對(duì)照提高了13.4％，但并未達(dá)到野生型酵母錳含量的水平，說(shuō)明表達(dá)SaZIP3只在

5、一定程度上恢復(fù)了突變體吸收錳的功能，而SaZIP2在酵母中不具備轉(zhuǎn)運(yùn)錳的能力;轉(zhuǎn)化SaZIP2和SaZIP3更加減弱了鐵吸收缺陷型突變體DDY4吸收鐵的能力，但不影響突變體鐵含量。上述酵母功能互補(bǔ)試驗(yàn)說(shuō)明，SaZIP2和SaZIP3均能介導(dǎo)鎘、鋅和鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)，且SaZIP3能介導(dǎo)錳的轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　2、利用Gateway技術(shù)構(gòu)建GFP融合載體，采用基因槍技術(shù)將其導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞，暗培養(yǎng)16h后用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)綠色熒光，SaZIP2

6、-GFP融合載體表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)液泡以外的地方呈現(xiàn)點(diǎn)狀分布，SaZIP3-GFP融合載體表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞膜和細(xì)胞核膜上分布，暗示SaZIP2是分布在除液泡膜以外細(xì)胞器質(zhì)膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，SaZIP3是分布在細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞核膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。但SaZIP2究竟分布在何種細(xì)胞器質(zhì)膜上，以及SaZIP3分布在核膜上的作用還有待進(jìn)一步研究。
　　3、采用營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)試驗(yàn)，利用q-RT-PCR比較分析了鋅/鎘處理下ZIP2和ZIP3在兩種生態(tài)型東南

7、景天(超積累生態(tài)型HE，非超積累生態(tài)型NHE)中的表達(dá)水平，及其與東南景天的鋅、鎘含量的關(guān)系。長(zhǎng)時(shí)間缺鋅處理會(huì)增加NHE和HE地上部、根部ZIP2和ZIP3的表達(dá)量，加鋅處理則有抑制效果，說(shuō)明ZIP2和ZIP3是高親和的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。5μM鎘處理NHE24 h和8d，SnZIP2基因在其地上部表達(dá)分別上調(diào)2倍和7倍，在根部表達(dá)分別下調(diào)25倍和4倍，說(shuō)明SnZIP2在地上部能特異性轉(zhuǎn)運(yùn)鋅，在根部還轉(zhuǎn)運(yùn)鎘。HE只在100μM鎘處理8d的情況下

8、，地上部SaZIP2表達(dá)量顯著上調(diào)，說(shuō)明SaZIP2在HE中非特異性吸收鋅，還參與了鎘從根部到地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)。5μM鎘處理NHE24 h和8d，SnZIP3基因在其地上部表達(dá)分別上調(diào)近5倍和下調(diào)近4倍，在根部表達(dá)分別上調(diào)近6倍和近8倍，說(shuō)明SnZIP3在NHE中是高親和且特異性強(qiáng)的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。鎘處理對(duì)HE地上部SaZIP3表達(dá)有抑制作用，且隨著鎘濃度的增加，抑制程度加強(qiáng)，低濃度的鎘處理對(duì)HE根部SaZIP3表達(dá)有促進(jìn)作用，而高濃度的鎘長(zhǎng)時(shí)

9、間處理有抑制作用，說(shuō)明在HE中SaZIP3非特異性轉(zhuǎn)運(yùn)鋅，還參與了根部鎘吸收。
　　4、通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將SaZIP2和SaZIP3基因過(guò)表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥中，采用平板和水培的方法觀(guān)察轉(zhuǎn)基因擬南芥的鋅、鎘耐性和積累量變化，以驗(yàn)證SaZIP2和SaZIP3基因的功能。過(guò)表達(dá)SaZIP2或SaZIP3的擬南芥同野生型(WT)在鋅、鎘處理下根系生長(zhǎng)受抑制程度一致，根系長(zhǎng)度明顯變短，說(shuō)明它們并不參與鋅鎘的區(qū)隔解毒過(guò)程，與它

10、們并不定位在液泡膜上的研究結(jié)果相符。50μM ZnSO4處理擬南芥一周，轉(zhuǎn)基因株系間地上部鋅含量沒(méi)有明顯差異，均顯著高于WT，是WT的90倍多，根部鋅含量有同樣的趨勢(shì)，轉(zhuǎn)基因株系根部鋅含量相對(duì)WT增加25％以上，轉(zhuǎn)基因株系鋅轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)是WT的7倍，說(shuō)明SaZIP2和SaZIP3參與鋅的吸收及向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。過(guò)表達(dá)SaZIP2株系的鎘轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)最高，地上部和根部鎘含量均高于WT，但差異不顯著，過(guò)表達(dá)SaZIP3的株系地上部和根部鎘含量分別