簡介：第一部分瘦素在肝纖維化組織中的表達研究目的探討瘦素在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展中的表達及臨床意義。結論瘦素的異常表達與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展有關，提示瘦素參與了肝纖維化的病理過程。第二部分靶向瘦素基因的SIRNAS真核表達質粒篩選平臺的建立目的構建具有特異性瘦素LEPTIN基因SIRNA功能的表達載體，篩選有效的靶向瘦素基因的SIRNA真核表達質粒。結論本研究構建的LEPTINSIRNAS表達載體中SIRNA278、SIRNA108、SIRNA97和SIRNA454有較強的抑制HSC的黏附力。第三部分靶向瘦素基因的SIRNAS對肝星狀細胞生物學活性的影響目的研究靶向LEPTIN基因的SIRNAS在大鼠肝星狀細胞中LEPTIN表達情況及對HSC生物學特性的影響。結論靶向LEPTIN基因的SIRNAS通過抑制靶基因及下游基因的表達逆轉活化型HSC的生物學特征，因此為肝纖維化的基因治療提供一種新的方法。第四部分靶向LEPTIN的SIRNAS對瘦素信號轉導機制等的影響目的檢測靶向LEPTIN的SIRNAS對信號轉導蛋白PSTAT3和細胞因子TGFΒ1的影響，初步探討SIRNAS對LEPTIN的信號傳導機制等的影響。結論PSTAT3、TGFΒ1參與了LEPTIN在肝纖維化中的信號轉導；SIRNAS抑制信號轉導對于肝纖維化的治療有一定的前景。第五部分SIRNA聯合Α干擾素抗肝纖維化的實驗研究目的實驗研究表明SIRNA對肝星狀細胞有抑制作用。本實驗擬進一步研究Α干擾素ALPHAINTERFERON，ΑIFN與靶向LEPTIN的SIRNA97單獨及聯合作用對肝星狀細胞體外活性的影響。結論SIRNA97聯合ΑIFN的體外抗纖維化作用比單獨應用ΑIFN和SIRNA97效果好。第六部分奧曲肽對大鼠肝星狀細胞胞質內游離鈣及細胞增殖的影響目的探討在常氧和低氧條件下奧曲肽OCTREOTIDE對大鼠肝星狀細胞HEPATICSTELLATECELL胞內游離鈣CA2I及增殖的調節(jié)。結論缺氧可通過第二信使系統促進HSC的增生，而OCTREOTIDE無論常氧還是低氧條件下劑量依賴性抑制HSCS增殖；CAMP、CGMP參與了對HSC的調節(jié)。

簡介：目的通過觀察胰島素信號轉導中磷脂酰肌醇3激酶PI3K抑制劑沃曼青霉素WTMANNIN誘導胰島素抵抗IR后關鍵信號葡萄糖轉運蛋白4GLUT、絲裂原激活蛋白激酶MAPK基因表達的調節(jié)，探討IR信號傳導分子機理；研究胰島素樣生長因子IGFI刺激作用下對豬卵巢胰島素抵抗與正常顆粒細胞性激素生成及細胞色素芳香化酶P450AROM、膽固醇側鏈裂解酶P450SCC和類固醇激素急性調節(jié)蛋白STARMRNA的影響；中西藥胰島素增敏劑曲格列酮、二甲雙胍和小檗堿、丹參酮對IR的影響。方法對豬卵巢顆粒細胞進行體外培養(yǎng)，用PI3K抑制劑WTMANNIN誘導IR模型，以氚三標記葡萄糖檢測細胞中的糖元量，葡萄糖氧化酶法檢測細胞的葡萄糖消耗量，以化學發(fā)光法測定培養(yǎng)液中雌二醇E、孕酮P、睪酮T的水平，以免疫熒光對GLUT4、MAPK、PPARΓ蛋白定性分析，以WESTERNBLOT對GLUT4、PPARΓ蛋白表達定量分析，以逆轉錄聚合酶鏈反應RTPCR對GLUT、MAPK、P450SCC和STARMRNA半定量分析，以實時熒光PCR對P450AROM、PPARΓ定量分析。結論1WTMANNIN阻斷PI3K信號轉導產生IR，關鍵信號GLUT表達下降影響新陳代謝信號通路，產生IR，而MAPKMRNA水平升高，進而影響有絲分裂信號通路，說明卵巢中存在交替的胰島素信號通路。2首次提出應用通過PI3K抑制物WTMANNIN誘導胰島素抵抗的造模的方法，引起胰島靶組織對葡萄糖的攝取和利用減少，通過氚三標記葡萄糖及葡萄糖氧化酶法得到驗證。3IGF1刺激了顆粒細胞P450AROM、STAR、P450SCCMRNA的表達，引起雌激素分泌的增加。IR以后IGF1的干預刺激雄激素的合成和分泌，STAR、P450SCC的表達明顯增加了。4提出IGFI在卵泡發(fā)育中的作用和細胞內的信號傳導系統及卵巢微環(huán)境中激素與局部生長因子之間的相互調控作用。5丹參酮和小檗堿降糖的作用特點類似曲格列酮和二甲雙胍。6深入到卵巢細胞內分子水平探討IR信號傳導分子機理及中西藥胰島素增敏劑改善IR的分子機制。此研究有助于闡明有關IR的發(fā)病機制，尤其是其分子靶點及細胞內信號機制及為預防和控制PCOS，改善IR的必要性提供了證據，為傳統中藥的臨床應用提供了新的思路。

簡介：第一部分牽張力介導血管緊張素轉換酶2的表達及其對平滑肌細胞功能影響的研究血管重構被公認為高血壓、冠心病等心血管疾病的重要病理特點，它是指血管管腔面積及形態(tài)、管壁結構和成分、血管功能的慢性改變。機械性損傷、炎癥、低氧、血流動力學異常等多種因素均參與血管重構的形成。由于血管一直暴露于血流動力學的作用中，異常的血液流體力學在血管重構中的作用及其分子機制，受到國內外學者越來越多的關注。深入研究血管重構的分子機制，確定在這一過程中發(fā)揮重要作用的分子和潛在藥物靶點，對于預防和減少心血管疾病的死亡率具有重大意義。人體血管長期暴露于搏動性血流的沖擊下，主要承受著兩種形式的生物力，一種是平行于血管長軸的剪切力SHEARSTRESS，主要作用于血管內皮細胞另一種是垂直于血管長軸的牽張力STRETCHSTRESS，可影響血管壁各種細胞成分，但位于管壁中層的平滑肌細胞是其主要靶細胞。兩種生物力對于血管功能的調節(jié)均具有重要作用。研究認為，平滑肌細胞受到牽張力的刺激時，其胞膜表面的各種受體分子、離子通道等將膜外機械性的刺激信號轉化為胞內的生物信號，激活一系列胞內信號轉導通路及轉錄因子，通過影響相關基因的表達調節(jié)細胞增殖、凋亡、遷移、分化等生物學功能。腎素血管緊張素（RAS）系統是影響血管形態(tài)與功能的重要因素。由血管緊張素轉化酶ACE催化產生的血管緊張素ⅡANGⅡ是RAS系統的主要效應分子，它在心血管重構過程中發(fā)揮重要作用。ANGⅡ不僅具有直接刺激平滑肌細胞增殖、遷移等功能改變的作用，還介導牽張力對平滑肌細胞生物學功能的影響與相應的細胞內信號轉導通路的激活。在體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞和成纖維細胞中，牽張力刺激能夠誘導心肌細胞分泌ANGⅡ，而且不依賴于ANGⅡ而上調腎素、ACE、AT1R、AT2R等基因的表達，而在心肌成纖維細胞中則沒有上述作用，這說明牽張力本身具有獨立調控局部RAS系統基因表達的作用，而且具有一定的細胞特異性。新近的研究也表明是組織局部RAS，而不是循環(huán)RAS和炎癥因子，對高血壓性心血管重構起著重要作用。因此，進一步探索血管局部RAS系統在牽張力介導的血管生物學功能中的作用及其機制具有重要的臨床意義。血管緊張素轉化酶2ACE2是一個新發(fā)現的RAS系統成員，對其生物學功能的研究成為近年來的熱點。研究發(fā)現，ACE2具有降解ANGⅡ生成血管緊張素17ANG17的作用，后者通過其特異的MAS受體，拮抗ACEANGⅡ信號通路的不良生物學作用，其被認為是RAS系統的負性調節(jié)因子，也是參與心血管重構的重要分子。此外，如RAS系統其它組分一樣，實驗證實生物力學因素也可以調節(jié)ACE2的表達。ACE2在血管內皮細胞及動脈平滑肌細胞中均有表達，其組織特異性表達及其對關鍵血管活性肽ANGⅡ獨特的分解能力，提示它在血管局部RAS中扮演重要角色。與RAS系統的ACEANGⅡAT1R軸相比，ACE2與生物力學的關系目前還知之甚少。由于ACE2在心血管重構中的保護作用及其對心血管細胞增殖、遷移、膠原代謝等生物學功能的影響，我們推測其在牽張力調節(jié)平滑肌細胞功能中發(fā)揮重要作用?；诮陙淼难芯繉CE2在血管平滑肌細胞功能中作用的闡述，以及牽張力調節(jié)平滑肌細胞功能的重要性，我們特提出以下科學假說1牽張力調節(jié)血管平滑肌細胞ACE2的表達，不同強度的牽張力對ACE2表達的影響不同2牽張力影響包括ACE2在內的RAS系統各主要成分的表達，ACE2ANG17MAS軸與ACEANGⅡAT1R軸在牽張力作用下，相互對抗、相互影響，參與不同大小牽張力對平滑肌細胞生物學作用的影響。研究目的1在體外細胞研究中，明確牽張力對血管平滑肌細胞ACE2表達及活性的影響。2明確ACE2在牽張力調節(jié)平滑肌細胞生物學功能中的作用。3通過體內實驗驗證力學對血管平滑肌細胞ACE2表達的影響。研究方法1細胞培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)人主動脈平滑肌細胞HASMCS，待細胞生長融合后，PBS沖洗細胞兩遍，以去除血清，加025％胰蛋白酶在細胞培養(yǎng)箱中消化2分鐘，在倒置顯微鏡下觀察到細胞變圓時，吸出胰蛋白酶，加入新的完全培養(yǎng)基吹打混勻，轉入新的細胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。2平滑肌細胞牽張力干預分組接種平滑肌細胞至鋪有Ⅰ型膠原的FLEXCELL六孔板中，待細胞生長至90％融合時，采用無血清培養(yǎng)基誘導細胞靜止24H，然后更換新的完全培養(yǎng)基，利用FLEXCELL5000TENSION細胞拉力儀給予細胞牽張力刺激，具體分組如下1靜止對照組不給予牽張力刺激，其它條件與牽張力干預組相同210％牽張力組給予最大峰值為10％的周期性牽張力分別刺激細胞1、3、6、12、24小時，牽張頻率為1HZ315％牽張力組給予最大峰值為15％的周期性牽張力分別刺激細胞1、3、6、12、24小時，牽張頻率為1HZ在各個時間點，不同強度牽張力干預平滑肌細胞結束后，連同靜止對照組一起收集細胞分別提取蛋白與總RNA，80℃保存待測血管緊張素ⅡANGⅡ及血管緊張素17含量（ANG17）。3細胞存活率檢測平滑肌細胞經不同強度牽張力刺激12小時后，胰酶消化的方法收集細胞，PBS重懸，臺酚藍染色液染色5分鐘，用血細胞計數板計數，計算細胞存活率。細胞存活率（細胞總數藍色細胞數）細胞總數100％。4實時熒光定量PCR檢測ACE2、ACE、MASMRNA表達根據試劑盒說明，用TRIZOL提取入主動脈平滑肌細胞總RNA，用TAKARA試劑盒進行逆轉錄，在BIORAD公司生產的IQ5上進行實時定量PCR。每個樣本重復測量三次。ACE2擴增引物序列上游5’CATTGGAGCAAGTGTTGGATCTT3’，下游5GAGCTAATGCATGCCATTCTCA3’ACE擴增引物序列上游5GCGGCTCTTCCAGGAGCTGC3’，下游5’CTGCGCCCACATGTTCCCCA3’MAS擴增引物序列上游5’GGCCTCCTCATGGATGGGTCAA3’，下游5’GTGCATTCCCGACTGAGGCGT3’ΒACTIN擴增引物序列，上游5TGACGTGGACATCCGCAAAG3’，下游5’CTGGAAGGTGGACAGCGAGG3。反應結束得到CT值（循環(huán)閾值），用相對定量的方法計算2ΔΔCT，并分析數據。ACE2、ACE、MASMRNA表達以管家基因ΒACTIN進行標準化。5WESTERNBLOT收集細胞后，提取胞漿胞膜總蛋白，加入蛋白上樣緩沖液，在99℃煮沸10分鐘，SDSPAGE電泳，轉膜，脫脂奶封閉，用1TBST洗膜3次。將PVDF膜放入合適比例的一抗中，4℃孵育過夜，洗膜。合適比例的二抗孵育1小時，洗膜，最后采用MILLIPE顯色液進行發(fā)光，柯達膠片顯影完成后觀察結果。6ACE2活性測定各種條件干預后收集細胞，提取胞漿蛋白。采用7MCAYVADAPKDNP作為反應底物，ACE及ACE2都能分解這一底物的2，4二硝基苯基部分，而2，4二硝基苯基能夠淬滅7甲氧基香豆素部分的熒光，它的分解造成熒光增強。20ΜG的總蛋白提取物與10ΜMOLL7MCAYVADAPKDNP混合后室溫下孵育，終容積為100ΜL。采用酶標儀讀取激發(fā)光320NM及散射光400NM的熒光強度，動態(tài)讀取熒光值4小時。ACE2活性定義為ACE2活性無抑制劑時的熒光強度ACE2抑制劑DX600存在時的熒光強度。每個樣本測量三次，最后數值采用RFUMGHOUR。7ANG17及ANGⅡ產物測定不同水平牽張力干預平滑肌細胞后，收集胞漿蛋白，ELISA法檢測胞漿蛋白中ANG17及ANGⅡ的含量。8細胞免疫熒光法檢測ACE2的表達HASMCS接種于FLEX5000TENSION6孔板中，至細胞生長至90％融合時，更換無血清培養(yǎng)基誘導細胞靜止24小時后，分為兩組，即靜態(tài)組、10％牽張力干預12小時組。干預結束后棄培養(yǎng)液，PBS洗3次，加入免疫染色固定液固定30MIN，PBS沖洗，剪下種有細胞的膜，采用免疫熒光染色，滴加相應抗體血清，再滴加1∶200熒光素標記的二抗，設陰性及空白對照。熒光顯微鏡下觀察、拍片，直觀明確牽張力對平滑肌細胞中ACE2的表達是否有作用。9細胞轉染利用陽離子脂質體，轉染不同濃度的ACE2小干擾RNAACE2SIRNA及陰性對照小干擾RNANEGATIVECONTROLSIRNA，ACE2SIRNA序列為FWARD5CCAUCUACAGUACUGGAAADTDT3REVERSE5UUUCCAGUACUGUAGAUGGDTDT3。NEGATIVECONTROLSIRNA序列為FWARD5UUCUCCGAACGUGUCACGUDTDT3REVERSE5ACGUGACACGUUCGGAGAADTDT3，。轉染48小時后收集細胞，提取胞漿總蛋白，WESTERNBLOT測定ACE2蛋白表達以評價干擾效果，選取合適的SIRNA濃度按照合適的SIRNA濃度進行下一步實驗。10ACE2在牽張力調節(jié)平滑肌細胞生物學功能中作用的研究1培養(yǎng)HASMCS，給予生理范圍的牽張力10％ELONGATION，1HZ刺激12H。2采用BRDU摻入法、細胞劃痕技術，明確牽張力對HASMCS增殖、遷移的影響。3預先轉染ACE2小干擾RNASIRNA及其陰性對照后再給予牽張力干預，觀察對上述平滑肌細胞生物學功能的影響，明確ACE2在牽張力調節(jié)HASMCS生物學功能中的作用。11體內實驗觀察壓力負荷改變對血管平滑肌細胞ACE2表達的影響1動物模型構建20只12周齡雄性C57BL6小鼠，分為兩組，手術組N10，假手術組N10。手術組自胸骨上窩結扎主動脈弓部致其縮窄，假手術組術式與手術組相同，但不做主動脈弓縮窄。并分別于術后24小時后處死動物留取標本。2壓力負荷改變與主動脈平滑肌細胞中ACE2表達的關系應用實時定量PCR、WESTERNBLOT技術分別測定主動脈弓結扎上、下游血管段ACE2的MRNA和蛋白表達水平免疫組化雙染測定ACE2在血管平滑肌細胞中的表達。12統計學分析所有數據采用均數±標準誤MEAN±SEM表示，兩兩比較采用T檢驗，多組之間比較采用單因素方差分析，使用SPSS160統計軟件分析，P＜005認為有統計學意義。結果1不同作用時間下，不同水平的牽張力對主動脈平滑肌細胞ACE2、ACE、MASMRNA表達的影響研究結果顯示，ACE2與ACE、MAS均為牽張力敏感的RAS基因。與靜態(tài)對照組比較，10％牽張力作用后1小時ACE2、MAS、ACEMRNA水平與靜態(tài)對照組相比未見明顯改變P＞005），作用3H后ACE2MRNA水平比靜態(tài)對照組明顯增高，于6H達峰31FOLD，P＜001，而且增高趨勢保持到24H，MASMRNA水平自3H開始上升，6H達到峰值24FOLD，P＜001，24小時仍比靜態(tài)對照組明顯增高，而ACEMRNA水平在1H、3H時輕度增高但無顯著性意義，在10％牽張力作用12H、24H時ACEMRNA水平較靜態(tài)組明顯降低041FOLD，P＜005與靜態(tài)對照組比較，15％牽張力作用3H后，ACE2、MASMRNA水平比靜態(tài)對照組表達增高分別為18FOLD，165FOLD，P＜001，P＜005，15％牽張力作用12、24小時后，其ACE2、MASMRNA水平比靜態(tài)對照組明顯降低037FOLD，044FOLD，P＜005，而ACEMRNA水平在15％牽張力作用6H顯著增高，12H達峰235FOLD，P＜001，于24H仍較靜態(tài)組明顯增加219FOLD，P＜001將PCR產物行瓊脂糖凝膠電泳結果顯示ACE2于108BP、ACE于142BP、MAS于94BP處顯示清晰的條帶。為了觀察RAS系統中兩個主要的酶對相同牽張力的不同反應，我們比較了相同牽張力情況下ACE2及ACE的變化情況，結果表明在10％的牽張力作用下1小時，ACE2比ACE明顯上調P＜005，而繼續(xù)牽張3H至24H，與ACE的MRNA水平相比，ACE2始終明顯高表達P＜001而15％的牽張力作用1小時、3小時，ACE2與ACE的MRNA表達沒有顯著性差異，繼續(xù)牽張至6小時，ACE的MRNA表達較ACE2明顯上調P＜005，至12、24小時，ACE的MRNA表達保持顯著上調P＜001。2WESTERNBLOT結果WESTERNBLOT結果顯示，10％牽張力干預細胞1、3小時，ACE2蛋白表達未見有明顯改變P＞005，干預HASMCS6小時后，ACE2蛋白表達較靜態(tài)對照組明顯升高（P＜001），10％牽張力干預24小時之后，ACE2蛋白表達水平仍然增高P＜001而15％牽張力刺激細胞3小時后，引起ACE2蛋白表達水平短暫升高P＜001），而在12、24小時，ACE2表達呈明顯下調趨勢P＜001。3ACE2活性變化10％牽張力分別干預HASMCS1、3、6小時后，ACE2活性沒有顯著改變12小時后，ACE2活性比靜態(tài)對照組明顯增加并達到峰值P＜001，而且這種增高趨勢持續(xù)到24H15％牽張力分別干預HASMCS1、3、6小時，對ACE2的活性均沒有顯著影響，干預12、24小時后，ACE2活性顯著降低P＜001。4牽張力對ANG17及ANGⅡ產生量的影響10％牽張力作用1H、3H、6H后，ANGⅡ、ANG17水平與靜態(tài)對照組相比未見明顯改變P＞00510％牽張力作用12H、24H后，與靜態(tài)對照組相比，ANGⅡ水平明顯降低P＜001，而ANG17水平明顯升高P＜005，P＜001。15％牽張力作用1H、3H后，ANGⅡ、ANG17水平比靜態(tài)對照組無明顯變化，15％牽張力作用6H后，其ANGⅡ水平比靜態(tài)對照組顯著增加P＜005，而ANG17水平較靜態(tài)組無顯著變化P＞005。15％牽張力作用12H、24H后，ANGⅡ水平比靜態(tài)對照組顯著升高P＜005，P＜001，而ANG17水平明顯降低P＜005，P＜001。5ACE2免疫熒光法檢測結果給予HASMCS10％周期性牽張力干預12小時，細胞免疫熒光進一步顯示與靜態(tài)培養(yǎng)相比，生理牽張力顯著上調ACE2蛋白表達水平。6ACE2在牽張力調節(jié)平滑肌細胞生物學功能中的作用1采用BRDU摻入法結果提示10％牽張力能夠抑制HASMCS的增殖。2細胞劃痕實驗證明10％牽張力能夠抑制HASMCS的遷移。3轉染ACE2SIRNA48小時后ACE2表達水平顯著下調，與單純牽張力組比較，下調ACE2的表達能夠部分抵消10％牽張力抑制平滑肌細胞增殖、遷移的作用。7組織免疫熒光檢測結果實驗動物共20只，除1只死于手術前麻醉外，其余全部成活并順利完成實驗。組織免疫熒光結果顯示與假手術組相比，ACE2在結扎近心端的主動脈平滑肌細胞中表達明顯減低而在結扎遠心端的主動脈平滑肌細胞中表達沒有明顯改變WESTERNBLOT及實時定量PCR結果亦顯示主動脈弓結扎近心端ACE2蛋白及MRNA表達水平下調，而主動脈弓結扎遠心端血管段ACE2表達沒有變化。結論1生理性牽張力能夠持續(xù)上調平滑肌細胞中ACE2的表達，而病理性牽張力早期雖上調ACE2表達，但隨干預時間延長其表達呈現下調趨勢。2ACE2參與生理牽張力對平滑肌細胞增殖、遷移的抑制作用3在主動脈弓結扎的小鼠中，與假手術組相比，異常的牽張力增加可以降低血管平滑肌細胞ACE2的表達。第二部分牽張力調控血管平滑肌細胞ACE2的分子機制研究由于血管一直暴露于血流動力學的作用下，異常的血液流體力學可作用于血管壁細胞導致動脈血管病變的發(fā)生、發(fā)展。我國高血壓患者已高達2億，高血壓病往往伴有周期性機械牽張力的增加，從而引起血管壁平滑肌細胞的形態(tài)和功能改變，進一步造成血管重構，導致高血壓終末器官損害如心、腦血管疾病及高血壓腎病的發(fā)生、發(fā)展位于血管壁中層的平滑肌細胞的形態(tài)和功能異常在動脈血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。腎素血管緊張素RAS系統與心血管疾病密切相關，近年來，RAS系統新成員血管緊張素轉化酶2ACE2對血管的保護作用受到了重視，ACE2在高血壓大鼠血管壁中、糖尿病心肌病和腎病以及心肌梗死動物模型中可以改善心臟及血管重構。我們實驗室最近的研究證明在動脈粥樣硬化模型中ACE2過表達可延緩斑塊的發(fā)生發(fā)展，具有減少斑塊易損指數，穩(wěn)定斑塊的作用。機械牽張力可影響平滑肌細胞ANGⅡ的分泌，但是對于ACE2的作用尚不明了。我們的前期研究發(fā)現與靜態(tài)對照組比較，生理牽張力10％ELONGATION，1HZ顯著上調血管平滑肌細胞ACE2的表達及活性，而過度增強的病理牽張力15％ELONGATION，1HZ卻下調血管平滑肌細胞ACE2的表達與活性，此外，我們的前期研究還發(fā)現ACE2參與牽張力對平滑肌細胞增殖、遷移功能的調節(jié)作用。這些研究提示機械牽張力可能通過ACE2影響平滑肌細胞的功能和血管壁的重構，但是牽張力調控ACE2的確切機制尚需進一步的深入研究。近年來關于牽張力調節(jié)平滑肌細胞功能的分子機制研究取得了一定進展。盡管迄今尚未發(fā)現細胞表面存在特異的生物力學信號感受器，但位于胞膜表面的整合素、酪氨酸受體激酶、離子通道、小凹蛋白等結構均可以將胞外的力學刺激傳導到胞內，激活PKC、MAPK、PI3KAKT等多種信號轉導通路以及活化AP1、NFΚB、EGR1、SP1等多種轉錄因子，最終通過改變細胞增殖、凋亡、表型分化等相關基因的表達而影響細胞功能。近年來，有關學者利用病毒載體或人工重組合成ACE2，在動物水平充分證明了ACE2的心血管保護作用，在體外水平上驗證了其對各種細胞生物學功能的影響。然而，各種病理生理刺激調控ACE2表達的分子機制目前還知之甚少。盡管有研究發(fā)現在體外培養(yǎng)的平滑肌細胞中ANGⅡ可以通過激活ERK12信號通路抑制ACE2表達，但另一項研究卻發(fā)現在肝星狀細胞中，ANGⅡ上調ACE2的表達此外，研究表明過表達ACE2同樣可以抑制ACE、AT1R的表達，及ANGⅡ的分泌。以上充分說明了ACE2表達調控與RAS系統各組分之間關系的復雜性。既往有研究表明，高糖可以下調PKCΒⅡ的表達，后者可以下調SMCS中ACE2的表達及ANG17的生成牽張力可以激活MAPK、AKT、PKC信號通路，并活化AP1、NFΚB、SP1等轉錄因子，而ACE2啟動子序列中含有多個AP1、SP1結合位點。但是牽張力如何影響ACE2表達的機制目前尚未見文獻報道。目前在心血管領域，關于ACE2的研究大多數集中在對其下游功能的研究上，而對其自身表達調控知之甚少，牽張力通過什么信號通路調節(jié)血管平滑肌細胞上ACE2的表達AP1、NFΚB是否參與牽張力調節(jié)ACE2表達這些問題都有待實驗進一步證實。本研究擬在前期研究的基礎上，深入研究生理性周期牽張力10％ELONGATION，1HZ調節(jié)血管平滑肌細胞ACE2表達的分子機制，該研究將對動脈血管疾病的發(fā)生機制提供新的思路，對進一步理解RAS系統在維持血管功能與血管重塑中的作用與機制，尋找干預血管重構相關疾病的新靶點，具有重要的現實意義。研究目的1明確生理牽張力對ACE2啟動子活性及MRNA穩(wěn)定性的影響2確定生理牽張力調節(jié)人平滑肌細胞ACE2表達的關鍵轉錄因子3明確生理牽張力調節(jié)人平滑肌細胞ACE2表達的主要信號通路。研究方法1人主動脈平滑肌細胞培養(yǎng)及牽張力干預前期實驗購得人主動脈平滑肌細胞株HASMCSCIENCELL，采用SCIENCELL平滑肌細胞專用培養(yǎng)基SMCGS、2％FBS、1％PENICILLINSTREPTOMYCIN培養(yǎng)細胞，47代細胞用于實驗。接種平滑肌細胞HASMCS至鋪有Ⅰ型膠原的FLEXCELL六孔板中（105個細胞孔），待細胞生長達90％融合時，無血清培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)24小時，更換新的完全培養(yǎng)基，使用FLEXCELL5000TENSION細胞拉力儀給予細胞牽張力10％ELONGATION，1HZ刺激。2細胞牽張力干預分組21、牽張力對ACE2MRNA穩(wěn)定性的影響1靜態(tài)對照組靜態(tài)培養(yǎng)平滑肌細胞，不給予任何通路抑制劑干預。2牽張力干預組給予HASMCS牽張力10％ELONGATION，1HZ刺激12小時。牽張力刺激12小時后，與靜止對照組一起，添加放線菌素D5UGML至細胞培養(yǎng)上清中，以抑制新的轉錄，分別用放線菌素D干預0、6、12小時，利用TRIZOL提取細胞總RNA并逆轉錄為CDNA，利用實時熒光定量PCR檢測MRNA的表達，結果以不同時間點的MRNA水平與加入放線菌素D0小時的MRNA的比值來表示。觀察與靜態(tài)對照組相比較，生理牽張力是否增加平滑肌細胞ACE2MRNA的穩(wěn)定性。22、牽張力對ACE2啟動子活性的影響設計ACE2啟動子PCR擴增引物，PCR擴增、電泳后切膠，并行PCR產物回收，連接T載體和細胞轉化，構建ACE2啟動子載體PGL3ACE2PROMOTER，利用INVITROGENLIP2000將啟動子載體與PRLTK載體共轉染平滑肌細胞24小時后，給予牽張力10％ELONGATION，1HZ刺激3小時或靜止培養(yǎng)3小時，利用PROMEGA雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測牽張力10％ELONGATION，1HZ對ACE2啟動子活性的影響。23、確定介導生理牽張力10％ELONGATION，1HZ調節(jié)平滑肌細胞ACE2表達的關鍵轉錄因子1靜態(tài)對照組靜態(tài)培養(yǎng)平滑肌細胞，不給予任何通路抑制劑干預。2牽張力對照組分別給予HASMCS牽張力干預15MIN、30MIN、1H、2H。3SN50組先給予HASMCSSN5018ΜM預處理1小時，再給予牽張力刺激6小時。4CURCUMIN組先給予HASMCSCURCUMIN10UM預處理1小時，再給予牽張力刺激6小時。5WP631組先給予HASMCSWP631100NM預處理1小時，再給予牽張力刺激6小時。WESTERNBLOT檢測P65、PP65、CFOS、PCFOS、CJUN、PCJUN、SP1、PSP1、ACE2蛋白表達實時熒光定量PCR檢測ACE2MRNA變化EMSA檢測NFΚ3、AP1的DNA結合能力24、MAPK信號通路在牽張力10％ELONGATION，1HZ調節(jié)平滑肌細胞ACE2表達中的作用1靜態(tài)對照組靜態(tài)培養(yǎng)平滑肌細胞，不給予任何通路抑制劑干預。2牽張力對照組分別給予HASMCS牽張力刺激15MIN、30MIN、1H、2H。3PD98059組先給予HASMCSERK12抑制劑PD9805930UM預處理1小時，再給予牽張力刺激6H。4SP600125組先給予HASMCSJNK12抑制劑SP600125（20ΜM）預處理1小時，再給予牽張力刺激6H。5SB203580組先給予HASMCSP38抑制劑SB20358010ΜM預處理1小時，再給予牽張力刺激6H。WESTERNBLOT檢測ERK12、PERK12、P38、PP38、JNK12、PJNK12、ACE2的蛋白表達實時熒光定量PCR檢測ACE2MRNA變化并檢測下游轉錄因子的活性。25、PKCⅡ信號通路在牽張力10％ELONGATION，1HZ調節(jié)平滑肌細胞ACE2表達中的作用1靜態(tài)對照組靜態(tài)培養(yǎng)平滑肌細胞，不給予任何通路抑制劑干預。2牽張力對照組分別給予HASMCS牽張力刺激15MIN、30MIN、1H、2H。3CG53353組先給予HASMCSPKCΒⅡ抑制劑CG53353（100NM）預處理1小時，再給予牽張力刺激6H。觀察PKCΒⅡ的磷酸化水平ACE2MRNA及蛋白表達水平下游轉錄因子的活性。26、AKT信號通路在牽張力10％ELONGATION，1HZ調節(jié)平滑肌細胞ACE2表達中的作用1靜態(tài)對照組靜態(tài)培養(yǎng)平滑肌細胞，不給予任何通路抑制劑干預。2牽張力對照組分別給予HASMCS牽張力刺激15MIN、30MIN、1H、2H。3LY294002組先給予HASMCSAKT抑制劑LY29400250ΜM預處理1小時，再給予牽張力刺激6H。觀察AKT、PAKT的表達ACE2MRNA、蛋白表達水平。3實驗方法應用實時定量PCR法檢測ACE2MRNA的表達量用WESTERNBLOT技術檢測信號蛋白表達和磷酸化水平EMSA檢測AP1、NFΚB與DNA的結合活性。4統計學分析實驗數據以均數±標準誤表示。使用SPSS160軟件中的單因素方差分析對結果進行分析，兩兩比較采用T檢驗。P＜005認為差異具有統計學意義。結果1牽張力對ACE2MRNA穩(wěn)定性無明顯影響給予HASMCS10％周期性牽張力干預12小時后，與放線菌

簡介：皮膚是阻止微生物、化學物質等侵入以維持內環(huán)境穩(wěn)定的屏障，燒傷主要損害是皮膚壞死，大面積皮膚缺損可引起全身的改變。因而創(chuàng)面處理是燒傷救治的重要環(huán)節(jié)之一，大面積皮膚缺損創(chuàng)面的覆蓋與修復一直是臨床醫(yī)師倍感棘手的問題。燒傷創(chuàng)面的修復是一個十分復雜的生物學過程，包括炎癥反應、細胞增殖和遷移、膠原與細胞外基質的沉積以及再上皮化等。目前，燒傷創(chuàng)面修復方法主要是以局部治療為主。大面積深度燒傷患者由于自體皮源不足，多年來運用網狀植皮、郵票植皮、小皮片移植、微粒植皮等技術來擴大皮膚覆蓋面積，取得了較好的臨床效果。但這些方法皮膚擴增面積有限，難以滿足大面積皮膚缺損患者盡早封閉創(chuàng)面的需求，在加快創(chuàng)面愈合的速度和改進創(chuàng)面愈合質量，從而在減少功能障礙的發(fā)生率和提高患者生活質量方面，目前常規(guī)應用的這些方法顯然還存在著很多不足。組織工程學的興起和發(fā)展，為臨床解決這一難題提供了嶄新的思路和途徑。組織工程將體外分離、培養(yǎng)的高濃度的功能相關的活細胞種植于天然的、人工合成的支架上，使之植入人體后能夠形成新的有功能的組織，來制造、保存或修復失去的組織功能。組織工程化人體組織或器官產業(yè)化生產的一個關鍵因素是植入足夠數量的、不引起免疫反應的、具有再生活力的細胞。其中種子細胞的體外培養(yǎng)擴增成為組織工程學中的重要環(huán)節(jié)。理想的種子細胞應具有容易獲得，容易體外培養(yǎng)增殖，長期傳代不改變生物學特征，抗原性小，組織修復能力強等特征。目前，有關皮膚種子細胞的研究主要集中在表皮細胞大規(guī)模培養(yǎng)和表皮干細胞研究，以及胚胎干細胞向表皮細胞定向誘導分化等幾個方面。表皮細胞大規(guī)模培養(yǎng)雖已有成功應用的報道，但仍存在生產周期長、技術要求高和費用昂貴等諸多限制正常皮膚內表皮干細胞數量有限，而大面積深度燒傷患者表皮干細胞來源更有限。同時表皮干細胞的分離、純化和培養(yǎng)技術尚不夠成熟；在胚胎干細胞方面，牽涉到倫理、技術等諸多障礙。因此有必要探索一條新的途徑來克服皮膚種子細胞的技術難度和瓶頸問題。近年來研究發(fā)現，骨髓組織除含有造血干細胞外，還含有另一類干細胞骨髓間充質干細胞MESENCHYMALSTEMCELLS，MSCS。MSCS具有干細胞的共性，即自我更新及多向分化能力。大量研究證實，在一定誘導條件下MSCS可向成骨細胞、成軟骨細胞、成肌細胞、肌腱細胞、脂肪細胞及基質細胞等中胚層細胞分化；同時MSCS還可以向外胚層的神經元細胞和內胚層的肝卵圓細胞分化。已有研究表明，把骨髓MSCS植入體內，可向多種造血以外的組織如肺、骨、軟骨和皮膚等處定位并分化為相應的組織細胞。骨髓間充質干細胞不僅具有無限增殖、多向分化的潛能，而且還有明顯的可塑性，體內移植后能遷移到病變部位并轉化為病變部位的細胞等特點。骨髓MSCS獲取簡便，簡單的骨髓穿刺即可獲得，體外培養(yǎng)條件不高，細胞分裂增殖快，MSCS可取自自體，不存在免疫排斥問題，即便是異體移植，由于骨髓MSCS屬于未分化的前體細胞，其細胞表型的分化尚不成熟，因而MSCS移植排斥反應弱。而且MSCS體外基因轉染率高，故MSCS被認為是良好的組織工程的種子細胞，具有潛在的臨床應用前景。由此可見MSCS有可能作為皮膚組織工程的種子細胞，參與燒傷創(chuàng)面的愈合。WISTAR大鼠是醫(yī)學研究中使用最廣泛的實驗動物之一，本研究以WISTAR大鼠為研究對象，比較分析不同條件下分離和培養(yǎng)的大鼠MSCS的生物學特性，并對其進行鑒定，以建立一種簡單、有效、經濟、實用的分離、培養(yǎng)MSCS的方法。將綠色熒光蛋白基因通過脂質體轉染MSCS，觀察其是否可應用于組織工程修復技術的細胞標記。目的應用不同方法分離和培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞，優(yōu)化MSCS的分離方法，尋找一種經濟、實用而又簡便的分離和培養(yǎng)MSCS的方法，為深入研究MSCS創(chuàng)造條件。方法分別采用全骨髓法直接貼壁法、PERCOLL分離液密度為1073G／ML及淋巴細胞分離液密度為1077G／ML梯度離心法分離MSCS，分別通過不同的首次換液時間進行培養(yǎng)，比較不同條件下分離和培養(yǎng)的貼壁細胞鋪滿整個培養(yǎng)瓶的底部所需時間及細胞生長特性、生長曲線和細胞貼壁率的差異，同時應用流式細胞儀檢測細胞周期和表面抗原CD44、CD90和CD45的表達。結果采用全骨髓法分離的骨髓細胞，首次換液時間為72H、96H進行培養(yǎng)后，獲得的細胞數量多，細胞貼壁后增殖較為迅速，貼壁細胞鋪滿整個培養(yǎng)瓶的底部所需時間均為6～7D，原代細胞純度不高，但傳代后，可獲得純度較高的MSCS；用密度為1073G／ML的PERCOLL分離液分離的骨髓細胞，首次換液時間為48H、72H、96H進行培養(yǎng)后，可獲得純度較高的MSCS，貼壁細胞鋪滿整個培養(yǎng)瓶的底部所需時間為13～21D；而應用密度為1077G／ML淋巴細胞分離液分離不能培養(yǎng)出梭形成纖維細胞樣貼壁生長的MSCS；首次換液時間過早很難獲得成纖維樣貼壁生長的MSCS。傳代后，細胞生長迅速，采用全骨髓法及PERCOLL分離液分離培養(yǎng)的細胞第1、2、3代之間生長曲線相似呈S型，在接種后的第1天、第2天為細胞的潛伏適應期，從第3天起細胞開始增殖并進入對數生長期，第6天左右細胞生長達頂點，以后進人平臺期，第8天時細胞數量有所減少。計算群體倍增時間采用直接貼壁法分離培養(yǎng)的第1、2、3代骨髓MSCS分別為302H、296H和292H，PERCOLL分離法分離培養(yǎng)的骨髓MSCS群體倍增時間分別是為298H、293H和290H。兩種方法分離培養(yǎng)的傳代細胞第1、2、3代之間的生長速度，經方差分析P005，還不能認為2種方法培養(yǎng)的細胞第L、2、3代細胞間的差異有統計學意義。結論本研究建立了體外分離純化、培養(yǎng)擴增大鼠骨髓MSCS的方法。應用全骨髓法首次換液時間不少于72H，應用密度為1073GML的PERCOLL分離方法首次換液時間不少于48H，進行培養(yǎng)可獲得成纖維樣貼壁生長的MSCS。PERCOLL分離法可以更好的提高MSCS的純度，但培養(yǎng)周期較長；全骨髓法培養(yǎng)周期短，但純度較差，傳代后細胞純度得以提高。第二部分增強型綠色熒光蛋白基因轉染大鼠骨髓間充質干細胞及其穩(wěn)定表達和影響目的檢測增強型綠色熒光蛋白EGFP表達載體PEGFPC1對大鼠骨髓間充質干細胞MSCS的轉染效率及其表達情況和對細胞生長的影響。為利用PEGFPC1轉染骨髓間充質干細胞提供依據。方法PEGFPC1質粒經體外擴增、提取、純化后，經酶切鑒定；以全骨髓法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質干細胞，取生長良好的第三代骨髓間充質干細胞；以脂質體介導法轉染PEGFP，應用熒光顯微鏡觀察轉染效率及熒光表達情況；通過G418篩選出抗性克隆，進行穩(wěn)定轉染，觀察熒光持續(xù)時間并檢測轉染細胞的生長曲線。結果綠色熒光蛋白在基因轉染24H后開始表達，PEGFP轉染MSCS的效率為12％，經過G418篩選后形成抗性克隆，表達持續(xù)4周以上，但熒光逐漸減弱。轉染后的細胞生長較未轉染細胞慢PO05。HE染色結果治療組創(chuàng)面愈合質量均好于對照組。PCR檢測結果表明，在治療組受體鼠的創(chuàng)面組織細胞有供體鼠Y染色體基因的表達；而且靜脈注射組骨髓組織中也檢測到了SRY基因的表達。免疫組織化學染色顯示對照組燙傷后7D真皮深層血管內皮細胞PCNA表達，14D呈強陽性，到21D、28D表達有所下降為。治療組PCNA表達與對照組無明顯差異；對照組燙傷后7D血管內皮細胞FAK表達，14D呈，到21D、28D表達有所下降為；靜脈注射組和局部注射組無明顯差異，燙傷后7D血管內皮細胞FAK表達14D呈強陽性，到21D、28D表達迅速下降為。對照組燙傷后7D，成纖維細胞胞漿中BFGF表達，14D新生肉芽組織表達增強，到21D、28D表達下降為。靜脈注射組和局部注射組無明顯差異燙傷后7DBFGF表達，14D新生肉芽組織表達強陽性，21D、28D表達下降。結論大鼠供體骨髓MSCS對其受體皮膚深Ⅱ度燙傷具有明顯的治療作用。燙傷促使骨髓間充質干細胞向創(chuàng)面遷移并參與燙傷創(chuàng)面愈合。

簡介：分類號～UDCY997187密級～編號，中南大學CENTRALSOUTHUNIVERSITY碩士學位論文論文題目學科專業(yè)；研究生姓名導師姓名及其盔窒透鑾宣亟疸紲胞鰒生物堂硒塞痘堡堂皇瘟堡生理堂揚垂對照比較有36個基因呈現差異表達，促進細胞增殖的基因在44F10組中表達上調，而在48A9組中限制細胞增殖的基因表達上調。差異性表達主要涉及細胞凋亡、細胞增殖、細胞周期調控和信號轉導的基因。結論空間環(huán)境可影響腫瘤細胞的生理特性，并且誘導細胞的變異是多向性的。而太空誘變宮頸癌細胞的差異基因表達是細胞生物學行為改變的原因。芯片關鍵詞空間環(huán)境，宮頸癌，生物學特性，差異表達基因，基因II

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簡介：Y994170四川碩士學學校代碼10610學號S032675大學位論文人成骨肉瘤順鉑耐藥細胞系的建立題目壁壘翅堂掛掛亞窶作專看垂塞餐業(yè)壁整堂L量塹2二00六年四月四』II大學華兩臨床醫(yī)學院碩士學位論文人成骨肉瘤順鉑耐藥細胞系的建立及生物學特性研究研究生張文韜導師屠重棋副教授摘要目的建立順鉑誘導的人成骨肉瘤多藥耐藥細胞系MG63／R并觀察其生物學特性。方法以順鉑為誘導劑，采用大劑量沖擊與逐步增ONJ；FJ量相結合的方法誘導人成骨肉瘤MG63細胞，建立多藥耐藥細胞系MG63／R。MTT法檢測藥物敏感性；光鏡、透射電鏡觀察MG63、MG63／R細胞形態(tài)及超微結構變化生長曲線、克隆形成試驗檢測細胞增殖能力；流式細胞術檢測細胞周期、凋亡指數、PGP、BCL2、P53蛋白表達。結果1經順鉑186天的誘導建立TMG63／R，MG63／R對順鉑的耐藥指數為83557，QN霉素、長春新堿、氨甲蝶呤、環(huán)磷酰氨亦產生不同程度的交叉耐藥；2光鏡觀察可見MG63／R細胞排列不規(guī)則，形態(tài)呈三角形、多角形及多核現象透射電鏡顯示撼63／R細胞表面突起增加，粗面內質網豐富；3細胞周期分析顯示MG63／R細胞G。／G。期868116％，S期為11，72，5％；MG63細胞G。／C期為907138％，S期為00L141％而MG63／R細胞凋亡明顯降低；

簡介：南方醫(yī)科大學碩士學位論文CD133陽性造血祖細胞對結直腸癌細胞生物學特性的影響姓名熊漢真申請學位級別碩士專業(yè)病理學與病理生理學指導教師李學農20080520中文摘要腫瘤模型上得到證實，由于臍血來源廣泛，獲取較容易，成為骨髓及外周造血干祖細胞的極佳替代來源，我們選定CDL33造血祖細胞，在減少其誘導分化的同時，觀察其對低轉移人大腸癌細胞體內外的增殖和侵襲作用。CDL33是一個目前公認的造血祖細胞表面抗原，在正常及異常造血和非造血組織中均有表達，隨著細胞的分化成熟其表達減弱、消失。在正常造血組織中，如人胚胎、肝臟和骨髓、臍血、成人骨髓和外周血CD34細胞中都可檢測到CDL33MRNA，而在其他成熟血細胞均未檢測到其表達。同時隨著最新的研究表明，CDL33MRNA在外周血中的表達里，實體惡性腫瘤轉移患者的表達水平明顯高于非轉移患者，且以骨轉移患者的CDL33MRNA表達為著。但這一結果的作用機制主要是由于CDL33造血祖細胞或者是CDL33腫瘤干細胞的結果尚不清楚。本研究重點探討CDL33造血祖細胞對結直腸癌增殖、侵襲及轉移的影響，闡明CDL33造血祖細胞在結直腸癌轉移中的主要生物學功能，為揭示結直腸癌轉移機制及抗轉移治療奠定基礎。方法1CDL33造血祖細胞的篩選、鑒定及培養(yǎng)由南方醫(yī)院婦產科提供新鮮臍血標本20例，在臍血采集后6H內，利用CDL33免疫磁珠，分離出CDL33造血祖細胞，并分別予流式細胞儀及免疫細胞染色分析和鑒定樣本量中CDL33細胞含量，同時在減少誘導CDL33分化的同時，培養(yǎng)CDL33造血祖細胞。2CDL33造血祖細胞對結直腸癌細胞生物學特性的影響將CDL33造血祖細胞與SW480共趨化培養(yǎng)，用MTT法檢測腫瘤細胞的增殖及黏附能力的影響，用TRANSWELL小室法檢測腫瘤細胞的遷移能力的變化，用WESTERNBLOT了解VEGFR1、MMP2、ECADHERIN的表達情況。觀察CDL33造血祖細胞作用前后細胞增殖、體外侵襲變化。3應用整體可視化結腸癌轉移動物模型觀察共移植效應

簡介：第三軍醫(yī)大學碩士學位論文NHE1基因調控細胞內酸堿平衡對SGC7901胃癌細胞生物學行為的影響姓名滕小春申請學位級別碩士專業(yè)內科學（消化系?。┲笇Ы處焺⒑７?0040501英文縮寫A260A280BPBCECFCDNADNADABDNTPDADMEMDMSOEDTAKBLBMTTMRNANHENHELODORIPAPIPBS英文縮寫詞一覽表英文全稱ABSORBANCCAT260NMABSORBANCEAT280NMBASEPAIRS2，7一BISCAEBOXYETHYL5OR6一CARBOXYFLUORESCEINCOMPLEMENTARYDEOXYRIBONUCLEICACIDDEOXYRIBONNUCLEICACID33“DIAMIONBENZIDENEDEOXYNUCIEOSIDETRIPHOSPHATEDALTONDULBECCOSMINIMUMESSENFIALDULBECCOS∞RMODIFIEDEAGLEMEDIUMDIMETHYLSULFOXIDEETHYLENDIAMINOTETRAACETICACIDKILOBASEPAIRLURIABERTANI3一4，5一DIMETHYL一2一THIAZOLY2，5一DIPHENY一2HTETRAZALIUMBROMIDEMESSENGERRIBONUCLEICACIDNA一HEXCHANGERNA一HEXCHANGERLOPTICALDENSITYORIGINOFREPLICATIONPASCALPROLIFERATIVEINDEXPHOSPHATEBUFFEREDSALINE中文全稱260NM處吸光度280RIM處吸光度堿基對2’，7’耳J基熒光素互補DNA脫氧核糖核酸3，3’一二氨基聯苯胺脫氧核苷三磷酸道爾頓極限必需培養(yǎng)基二甲基亞砜乙二胺四乙酸千堿基對LB培養(yǎng)基二苯基四氮唑溴鹽信使核糖核酸鈉。氫交換泵鈉氫交換泵第1亞型光密度復制起點帕壓力單位增殖指數磷酸緩沖鹽水

簡介：中山大學碩士學位論文PSMA對前列腺癌LNCAP細胞生物學行為影響的研究姓名曾樂祥申請學位級別碩士專業(yè)外科學指導教師郭正輝20100531中山大學碩士學位論文PSMA對前列腺癌LNCAP細胞生物學行為影響的研究分低的病例，并且PSMA在腫瘤新生血管系統表達，而在正常組織血管內皮不表達。終上所述，我們猜測PSMA與前列腺癌細胞的增殖、分裂、遷移、侵襲等行為是否存在著一定的聯系本課題組的前期研究針對PSMA構建了SHRNA慢病毒載體，轉染能高表達PSMA的前列腺癌LNCAP細胞后，通過REALTIMEPCR檢測PSMAMRNA的表達水平，通過WESTERNBLOT檢測PSMA蛋白的表達水平，發(fā)現PSMA的MRNA和蛋白均能被穩(wěn)定抑制，從而獲得了能穩(wěn)定低表達PSMA的前列腺癌LNCAP細胞。同時也培養(yǎng)了未處理的前列腺癌LNCAP細胞及獲得了轉染了與人類基因無同源性、對PSMA不起干擾作用的SIRNA的前列腺癌LNCAP細胞。研究目的研究PSMA對前列腺癌LNCAP細胞生物學行為的影響，為進一步研究PSMA在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起的作用打下基礎。研究方法實驗分組1PSMA基因被穩(wěn)定抑制的前列腺癌LNCAP細胞株實驗組；2未進行處理的前列腺癌LNCAP細胞株空白組；3轉染了與人類基因無同源性、對PSMA不起干擾作用的SIRNA的前列腺癌LNCAP細胞株對照組。以上述三組細胞為實驗對象，分別進行M實驗、流式檢測細胞周期、細胞劃痕實驗、TRANSWELL實驗，從而比較不同組細胞的生物學行為的變化。MTT實驗處理后在特定時間點測定相應的OD值，檢測不同組細胞的增殖能力，繪制生長曲線。流式檢測細胞周期通過流式細胞儀檢測細胞周期，根據處于細胞周期中S

簡介：天津醫(yī)科大學博士學位論文CD44在前列腺癌細胞遷移、增殖中作用的分子生物學基礎的研究姓名崔衛(wèi)國申請學位級別博士專業(yè)外科學（泌尿外）指導教師徐勇20040501墨鲞墾型查蘭蔓主蘭墮墮塞作用進行了基本的探討。其中包括1．使用不同的PRESENILIN抑制劑觀察其對前列腺癌PC一3細胞遷移和增殖表型的不同影響。2．觀察過量表達包含不同結構域的CD44分子對前列腺癌PC一3細胞遷移和增殖表型的不同影響。3．通過細胞組分分析和共聚焦顯微鏡直接觀察的方法研究CD44．ICD釋放后的亞細胞結構定位。4．通過對常見轉錄因子報告基因和信號傳導通路的檢測，研究釋放并轉移進核后的CD44．ICD，可能的基因調控通路。5．通過RNA干涉和反義RNA技術消除CD44基因在前列腺癌PC．3細胞中的表達，進而考察下調CD44表達對腫瘤惡性表型的逆轉。另外，上述實驗中使用明膠酶譜分析、“劃痕”法和MATRIGEL包被的TRANSWELL法等檢測PC3細胞的遷移表型；使用MTT法檢測細胞存活和生長，TUNE／法檢測細胞的凋亡。結果1．前列腺癌PC一3細胞中檢測到CD44和PRESENILINL／2的表達。2．PRESENILIN抑制劑DAPT和DUPE下調PC一3細胞中MMP9的表達，抑制了PC．3細胞劃痕后的修復和在MATRIGEL中的侵襲但另一種PRESENILIN抑制劑JLK2沒有上述抑制細胞迂移的效應。3．DAPT和DUPE處理的PC．3細胞存活率第3天開始下降，而且誘導細胞大量凋亡；JLK2處理的細胞存活正常，幾乎沒有凋亡。4．過表達CD44AE和CD44ICD的PC．3細胞遷移力明顯高于過表達CD44FL的細胞；過表達CD44FL、CD44AE和CD44ICD的PC一3細胞增殖率均有所升高，而且轉染CD44FL、CD44AE和CD44TCD并未誘導細胞的凋亡。5．DAPT和DUPE阻斷了CD44ICD從膜結合型CD44AE的水解釋放，JLX2沒有此種阻斷效應。6．CD44ICD可以逆轉DAPT對PC一3細胞中MMP9的表達的抑制作用。7．CD441CD從膜結合型CD44AE的水解釋放后轉移進核，并可能通過調控NFRD3等轉錄因子影響其下游信號通路傳導。8．RNAI}I1反義RNA技術均可有效的消除內、外源性CD44的表達。

簡介：浙江大學博士學位論文IL18基因修飾大腸癌SW480細胞生物學性狀的改變及抗腫瘤作用的研究姓名韓明勇申請學位級別博士專業(yè)腫瘤學指導教師鄭樹20050101浙江人學博。I二研究生畢業(yè)論文應答的誘導和效應階段具有重要的作剛。在免疫應谷的起始階段，細胞網子是必不可少的，細胞因子有調控免疫應答、活化效應細胞的復雜功能，尤其是CTL等效麻細胞的誘生更是離不開諸如IL一2等細胞因子，岡此將細胞因子編碼基網導入腫瘤細胞制備的腫瘤瘤莒可增強瘤苗的特異性免疫應答9J。應用分子生物學技術，采_I{J轉基囡手段以某些細胞網子基因修飾腫瘤細胞，提高其免疫原性或活化效應細胞的能力是舯瘤疫苗新的研究熱點”“。YEIT”1等將GMCSF基岡修飾黑色素瘤細胞，其表達定能于黑色素瘤細胞的細胞膜上，結果發(fā)現能促進瘤苗細胞與GMCSF受體陽性APC細胞的相互作用而增強腫瘤抗原的遞早，在小鼠模玳體內誘導了比分泌性GMCSF更強的免疫應答，并對野生型腫瘤細胞的攻擊更具保護力。白細胞介素．18INTERLEUKIN．18，IL．18是近年發(fā)現的一種多功能免疫調訂蚩向。它在體內分布廣泛，而且作用呈多樣化，除了誘導多種細胞岡子產生、上調FAS配體的表達，介導T細胞及NK細胞的細胞毒活性、增強機體臼然防御羽I抗腫瘤機能等作Ⅲ外研究表明IL．18也是一種炎性因子，還與骨代謝、神經羊¨造血功能有關I”“”。IL一18能明顯誘導IFN．Y、IL．2、TNF．N的產生，增強由FAS配體介導的NK細胞、T細胞和骨髓單核細胞的細胞毒活性等方面作_I|{，因而IL18具有顯著的抗腫瘤能力。研究發(fā)現【“1，給移植METHA肉瘤的小鼠預先注射IL．18后有90％PA上的實驗動物能K期存活。MICZLLEFT5】等研究發(fā)現腹腔內注射或靜脈內注射IL18可以引發(fā)機體對腹腔內注射的白體METHA肉瘤產生抗腫瘤效應，但皮R注射則無效。C26腫瘤細胞接種裸鼠后在1326天連續(xù)注射IL18能有效抑制舯瘤細胞的生長，可完全抑制其肺部轉移，裸鼠的生存期明顯延|支。IL18的處理也能明顯抑制MCA205肉瘤的生K，并且即使是接種后7天再處理也有效。同樣在小鼠黑色素瘤細胞株CL81接種斤連續(xù)7大腹腔注射IL一18LUG／只，可明顯抑制腫瘤的生K，使腫瘤生成瘤率由60％降至20％。另外，IL18對小鼠神經角質瘤也有明顯的殺傷效應㈣?；贗L．18的明顯抗腫瘤作Ⅲ，本研究構建含IL．18基岡的分泌型真核表達質粒將該真核表達質粒轉染人腸癌細胞系SW480細胞，觀察IL．18基岡轉導歷人腸癌細胞生物學行為的變化；將IL一18基岡轉染后的SW480細胞滅活，制備人腸癌基岡I群腫瘤疫茸，觀察其抗瘤作用。本課題內容分為四部分1含HLL．18基岡的分泌型真核表達質粒的構建2高表達HLL一18的太腸癌單克隆細胞株的建立；3HLL一18基岡修飾人腸癌細胞生物學行為的政變；4HLL一18基岡修飾人腸癌細胞腫瘤疫苗的制備及抗瘤作川研究。2

簡介：河北醫(yī)科大學學位論文使用授權及知識產權歸屬承諾本學位論文在導師或指導小組的指導卜，由本人獨矗完成。本學位論文研究所獲得的研究成果，其知識產權曠MJ北醫(yī)科大學所有。河北醫(yī)科入學有權對本學位論文進行交流、公開和使川。凡發(fā)表與學位論文主要內容相關的論文，第?！鹈麊挝粸楹颖贬t(yī)科人學，試驗材料、原始數據、中報的專利等知識產權均曠1河北醫(yī)科大學所有。否則，承擔相應的法律責任。，≮蕊麓、研究生簽名律翔闕F導師簽章寺亂二級學院羲尊麓喜Ⅲ簿}瀨蹲嗣‘、。、．、、，∥。4河北醫(yī)科大學研究生學位論文獨創(chuàng)性聲明本論文是在導師指導卜．進行的研究T作及取得的研究成果，除J7文中特另,JDH以標注等內容外，文中小包含其他人已發(fā)表或撰寫的研究成果，J}}導教師對此進行了市定。水淪義由本人獨立撰J，文責自負。研究牛簽名糊嘲}導師簽章于氟．。F與年弓月穸H中文摘要MIR139．5P與結腸癌細胞生物學功能的關聯研究摘要目的結腸癌COLONCANCER是常見的消化道惡性腫瘤之一，它的發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，在西方國家，結腸癌的發(fā)病率位于世界第二位，而在我國，它的發(fā)生率和死亡率則位于第四位，目前結腸癌在其早期診斷、早期治療方面取得了一定的成效，但其預后及5年生存率仍很低。本研究通過觀察MIR139．5P的表達對結腸癌細胞增殖、凋亡、細胞周期、侵襲和遷移的影響，初步探討MIR0139．5P在結腸癌發(fā)展過程中的作用，為結腸癌的早期篩查、基因的靶向治療以及預后提供理論依據。方法通過RTPCRREAL．TIMEPOLYMERASECHAINREACTION分析了95對結腸癌和癌旁正常組織以及所有的7種人類結腸癌細胞中MIR139．5P的表達水平；采用瞬時轉染的方法，將PRE．MIR139．5P和PREMIRCTRL分別轉染到結腸癌細胞株中，RTPCRREALTIMEPOLYMERASECHAINREACTION檢測其轉染效率；MTT法繪制出細胞生長曲線，TRANSWELL法檢測細胞的侵襲和遷移能力，流式細胞儀對轉染的結腸癌細胞株進行凋亡和細胞周期分析；最后通過WESTERNBLOT和PCR的方法驗證了與細胞侵襲、遷移及細胞凋亡相關基因的表達情況。采用●TTEST方法對分別轉染MIR139．5P和MIRCTRL的結腸癌細胞的增殖、侵襲、轉移、凋亡、及細胞周期方面進行檢驗和分析。結果1．通過實時定量PCR分析得出，與癌旁正常組織相比，MIR139．5P在結腸癌組織中表達是明顯降低的尸O．O001，MIR1395P的表達下調與結腸癌的遠處轉移存在著明顯的關聯儼O．031。同時與正常結腸細胞相比，在人類的7種結腸癌細胞中MIR139．5P的表達沉默或者減少。這些揭示了MIR139．5P在結腸癌中可能是一個潛在的腫瘤抑制因子。2．細胞生物學功能方面，通過細胞活力測定MTT和集落形成實驗，MIR139．5P在結腸癌細胞株DLDL，HCTLL6，SWLLL6中的表達可以明顯抑制結腸癌細胞的生長PO．0001，P0．0002，盧0．0022和集落的形成伊0．05。

簡介：點擊查看更多BALB-c裸鼠脾內移植人源性肝細胞的形態(tài)學和生物學特性研究.pdf精彩內容。

簡介：第二軍醫(yī)大學碩士學位論文IMPORTAZOLE和FENRETINIDE對骨髓瘤細胞生物學特性的影響及其機制研究EFFECTSOFIMPORTAZOLEANDFENRETINIDEONTHEBIOLOGICALCHAR?！癥ELOMACELLSANDTHEUNDERLYINGACTERLSTLCSOIMYCELLSANTEERWMRCNARMECHANISMS本課題由國家自然科學基金資助81172248碩士研究生顏文青指導老師侯健教授學科專業(yè)內科學血液病學培養(yǎng)單位第二軍醫(yī)大學研究生院二。一三年五月目錄中文摘要一1一英文摘要3縮略詞表5前言7刖舌’7第一部分IMPORTAZOLE對多發(fā)性骨髓瘤細胞生物學特性的影響一10一實驗材料與主要器材一10實驗方法一11一實驗結果20討論33結論一34第二部分FENRETINIDE對多發(fā)性骨髓瘤側群細胞生物學特性的影響35實驗材料及主要器材35實驗結果一39一討論52結論一53一參考文獻54一綜述一56一研究生在讀期間發(fā)表的論文63致謝64