簡(jiǎn)介：代謝控制工程提高大腸桿菌番茄紅素產(chǎn)量的研究WILLIAMRFARMERANDJAMESCLIAO化學(xué)工程系，加利福尼亞大學(xué)，洛杉磯，CA90034作者LIAOJUCLAEDU收稿日期19990808，接受日期20000222摘要代謝工程在復(fù)雜多樣的宿主內(nèi)產(chǎn)生外源代謝物方面取得了可喜的成果。但是代謝工程途徑主要集中在擴(kuò)大所需要的酶和解除細(xì)胞控制，因此沒(méi)有被控制的代謝途徑代謝失衡和不理想的產(chǎn)物出現(xiàn)。我們已經(jīng)闡述了代謝工程的另一種進(jìn)程，通過(guò)設(shè)計(jì)調(diào)控回路使調(diào)控子根據(jù)細(xì)胞內(nèi)代謝的狀態(tài)來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。尤其在大腸桿菌中恢復(fù)和改變調(diào)整回路體系中的一個(gè)NTR調(diào)控子來(lái)控制番茄紅素的生物合成途徑。被過(guò)量的糖分解刺激的人造的調(diào)控子，ACP控制番茄紅素中的兩個(gè)關(guān)鍵酶的表達(dá)，這正響應(yīng)了流體動(dòng)力學(xué)。這樣當(dāng)減少因代謝失衡引起的消極影響時(shí)，細(xì)胞內(nèi)操控系統(tǒng)就會(huì)明顯提高番茄紅素的產(chǎn)量。雖然我們論證這種可以提高代謝產(chǎn)量的方法，但是它也可被延伸到其他領(lǐng)域，而在這些領(lǐng)域中基因表達(dá)必須受細(xì)胞生理學(xué)嚴(yán)格的約束，如基因治療。關(guān)鍵詞類(lèi)胡蘿卜素，類(lèi)異戊二烯，代謝工程，代謝控制，氮調(diào)控子代謝工程在上個(gè)世紀(jì)就被認(rèn)為得益于對(duì)生物合成能力的充分理解，把向分析復(fù)雜生物資料和功能基因的學(xué)科進(jìn)軍作為進(jìn)步的結(jié)果。這種知識(shí)的直接優(yōu)勢(shì)是允許合理的新穎的路徑設(shè)計(jì)和排除先天反應(yīng)，而為了達(dá)到所需結(jié)果這種先天反應(yīng)是不必要的或有害的。但是，隨著代謝途徑越來(lái)越有效，代謝工程將面臨著一個(gè)新的挑戰(zhàn)即在這些路徑中控制基因表達(dá)的調(diào)整層次流程的再設(shè)計(jì)。除了要構(gòu)造代謝途徑的遺傳組成成分外，我們還要計(jì)劃使他變得像基因表達(dá)路徑動(dòng)力學(xué)那樣重要。很多學(xué)者認(rèn)為重組蛋白質(zhì)或細(xì)胞路徑的高水平感應(yīng)現(xiàn)象將導(dǎo)致生長(zhǎng)延遲和代謝活力的降低。這些表面特征有以下事實(shí)產(chǎn)生不斷的產(chǎn)品需求高于改變細(xì)胞生長(zhǎng)需求。我們希望這種普便情形能通過(guò)設(shè)計(jì)一個(gè)動(dòng)力控制器有所減輕，當(dāng)然這個(gè)動(dòng)力控制器能夠感受到細(xì)胞的代謝狀態(tài)和控制重組細(xì)胞路徑的表達(dá)。被命名為代謝控制工程的這種方法包括重新設(shè)計(jì)原來(lái)的路徑和將它們應(yīng)用于重組細(xì)胞路徑。這樣努力的目標(biāo)是控制重組細(xì)胞路徑的流量以適應(yīng)細(xì)胞新陳代謝的狀態(tài)。動(dòng)力控制重組細(xì)胞路徑可以潛在地導(dǎo)致產(chǎn)量提高、將生長(zhǎng)阻礙減小到最小、減少有毒副產(chǎn)品形成。適應(yīng)生理狀態(tài)的基因表達(dá)規(guī)則對(duì)于基因治療的成功也是十分必要的。這里我們舉一個(gè)這種方法應(yīng)用的例子在大腸桿菌中提高番茄紅素的產(chǎn)量。我們選擇番茄紅素作為典型例子是因?yàn)榉鸭t素對(duì)人類(lèi)的健康有益。番茄紅素作為一種有效的抗氧化劑，它已經(jīng)被提議治療一些癌癥和其他退行性疾病等，因此，具有活性的番茄紅素的合成物和其它相關(guān)的類(lèi)胡蘿卜素已經(jīng)越來(lái)越受人們的關(guān)注，并且有大量的報(bào)道在描述其產(chǎn)品。結(jié)果和討論重組細(xì)胞路徑構(gòu)建動(dòng)力學(xué)控制器。動(dòng)力控制器的目的是用來(lái)控制路徑的流量以利于C和能量的利用。如圖1所示設(shè)計(jì)這樣的一個(gè)細(xì)胞內(nèi)操作系統(tǒng)需要識(shí)別器1發(fā)信號(hào)分子反射相關(guān)代謝狀態(tài)（2）傳感器監(jiān)視信號(hào)（3）控制器處理感覺(jué)的輸入（4）控制閥（例如促進(jìn)器）調(diào)節(jié)基因表達(dá)（5）被控制路徑的速度限制裝置。鑒別正確的信號(hào)分子和速度限制需要對(duì)代謝系統(tǒng)有一個(gè)徹底地了解。剩下的成分則由兩種成分組成的調(diào)整體系衍生而來(lái)，其中這個(gè)體系包括大量的遺傳調(diào)整分子。圖1動(dòng)力控制學(xué)描繪控制工程的結(jié)構(gòu)圖被控制的過(guò)程是從葡萄糖到產(chǎn)物（番茄紅素）和一些廢品（例如醋酸鹽）的代謝途徑。標(biāo)準(zhǔn)變量（或信號(hào)）是ACP，ACP提供信號(hào)讓剩余的流量變成廢品。感受分子是NRI蛋白,它可以結(jié)合在DNA上調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。控制閥是啟動(dòng)子GLNAP2，它可以在代謝控制系統(tǒng)中控制受限的進(jìn)程（LDIANDPPS）。圖中虛線盒中指出代謝系統(tǒng)被控制。我們最初的任務(wù)是鑒別一種可以放映細(xì)胞內(nèi)代謝狀態(tài)的信號(hào)分子和一種能夠監(jiān)控它的傳感器。ACP可做為該代謝狀態(tài)的信號(hào)分子，因?yàn)樗呀?jīng)被用來(lái)作為葡萄糖上的指示劑。另外，它也已經(jīng)作為識(shí)別兩種混合成分調(diào)節(jié)子的標(biāo)準(zhǔn)，如CHE13,PHO14,ANDNTR15。提高ACP水平可以作為一種好的指示劑。因此，如圖1所示我們的方法是使用ACP作為信號(hào)分子來(lái)控制酶在想得到的路徑中的表達(dá)，同時(shí)也充分地利用過(guò)多的C流量和改變流量的方向以遠(yuǎn)離有毒產(chǎn)物醋酸鹽。為了理解ACP和控制基因表達(dá)，我們利用大腸桿菌的NTR調(diào)節(jié)子（圖2）。NTR調(diào)節(jié)子可以讓細(xì)胞適應(yīng)氮不足的狀態(tài)但是在大多數(shù)生物反應(yīng)器下它的作用可以忽落，因?yàn)榇藭r(shí)處于氮充足的環(huán)境下。NTR調(diào)節(jié)子自身的傳感器叫NRII,它是基因GLNL的產(chǎn)物，可以磷酸化的形式將磷酸轉(zhuǎn)移給NRI蛋白，NRI–P進(jìn)而與AP2結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)AP2的轉(zhuǎn)譯。在NRII缺失時(shí)，NRI才能響應(yīng)ACP水平。設(shè)計(jì)NRII缺失的回路控制，使NRI對(duì)ACP水平及目標(biāo)基因表達(dá)做出響應(yīng)（圖2A）。為了重建這種控制單位，我們限定在包含NRI粘合位點(diǎn)的區(qū)域和核GLNAP2啟動(dòng)子區(qū)域，并且插入DNA片段到克隆載體。NRI粘合位點(diǎn)重疊另一個(gè)被CAMPCRP調(diào)控的啟動(dòng)子GLNAP1。因此DNA片段也包含GLNAP1，但是沒(méi)有CAMPCRP粘合位點(diǎn)圖2A。沒(méi)有CAMPCRP活性，GLNAP2的活性相當(dāng)?shù)?，并且包含啟?dòng)子的信息構(gòu)造一個(gè)野生型菌株（JCL1595）來(lái)支持這個(gè)判斷（圖2B）。單一基因表達(dá)的動(dòng)力控制圖2動(dòng)力學(xué)控制器的描述（A）GLNAP2啟動(dòng)子在缺乏NRII時(shí)，ACP可誘導(dǎo)GLNAP2。NRI,NRI粘合位點(diǎn)GLNAP2核,GLNAP2核序列RBS,GLNA核糖體粘合位點(diǎn)ATG轉(zhuǎn)化開(kāi)始。標(biāo)注“35”和“10”區(qū)指出兩條RNA聚合酶的位置，其中RNA聚合酶和上游的GLNAP2啟動(dòng)子相接觸。來(lái)自單一復(fù)制GLNAP2LACZ的B,C?GAL活性構(gòu)造（B）細(xì)胞密度（在550NM的光學(xué)密度下）和（C）在JCL1595（GLNL）以及JCL1596GLNL中的醋酸鹽分泌物。來(lái)自野生型D?GALACTIVITY活性在葡萄糖有氧生長(zhǎng)期間單一復(fù)制PLACLACZ和菌株VJS632的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。用符號(hào)（●）代表細(xì)胞生長(zhǎng)，（■）代表?GAL的活性，（▽?zhuān)┐砑?xì)胞外的醋酸鹽。為了測(cè)試作為產(chǎn)物表達(dá)動(dòng)力控制器的GLNAP2的電位，我們引入GLNAP2LACZ信使核糖核酸的融合技術(shù)即通過(guò)??噬菌體進(jìn)入到GLNL宿主菌株JCL1596,同時(shí)測(cè)量?GAL活性的時(shí)間進(jìn)程。這種菌株包含GLNL2001等位基因。如圖2C所示當(dāng)GLNL宿主分泌醋酸鹽集中時(shí)GLNAP2?GAL活性增加，然而沒(méi)有啟動(dòng)子活性的感應(yīng)現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)然也沒(méi)有適應(yīng)于同基因的野生型（JCL1595）如（圖2B）示。因而在NRII缺失時(shí)，GLNAP2能夠?qū)^(guò)量的碳流量做出響應(yīng)，而過(guò)量的碳流量可以被醋酸鹽的排泄物反映出來(lái)。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入最后階段時(shí)，生物合成需求減少，細(xì)胞開(kāi)始層現(xiàn)出過(guò)量的碳流量。在這時(shí)，GLNAP2?GAL活性開(kāi)始上升。相反在野生型菌株（JCL1595）中GLNAP2?GAL活性相對(duì)降低，暗示出GLNAP2LACZ表達(dá)被在GLNL菌株JCL1596中的ACP調(diào)控，而不是被GLNAP1中的CAMP激活。如（圖2D）所示，菌株VJS632LAC中染色體PLAC的活性在IPTG感應(yīng)現(xiàn)象后迅速地增加，同時(shí)再細(xì)胞中完成了恒量水平的表達(dá)，這種表達(dá)不依賴(lài)于生長(zhǎng)期。因此，這種靜態(tài)的感應(yīng)現(xiàn)象不適應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)改變的需求，高水平的基因表達(dá)導(dǎo)致代謝失衡和生長(zhǎng)延遲。多種復(fù)制基因表達(dá)的動(dòng)力控制為了測(cè)定由GLNAP2提供的動(dòng)力控制是否能減輕因高水平的蛋白質(zhì)表達(dá)導(dǎo)致的代謝失衡和生長(zhǎng)延遲，而代謝失衡和生長(zhǎng)延遲通常在代謝工程中它是不可避免的。我們常使用兩種不同的代謝的酶，即PPS和DAHP合成酶，他們都處于GLNAP2啟動(dòng)子的控制下。以前曾報(bào)道過(guò)，蛋白質(zhì)無(wú)理由的過(guò)分表達(dá)導(dǎo)致生長(zhǎng)延遲。盡管如此，當(dāng)處于GLNAP2啟動(dòng)子的動(dòng)力控制下表達(dá)蛋白質(zhì)時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有停止，如（圖3A）所示。生長(zhǎng)壓抑的缺乏起初歸因于GLNAP2啟動(dòng)子側(cè)面感應(yīng)現(xiàn)象的動(dòng)力學(xué)。如（圖3C）所示PPS表達(dá)直到穩(wěn)定期才開(kāi)始增長(zhǎng)。因此，GLNAP2啟動(dòng)子避免過(guò)多的由蛋白質(zhì)過(guò)度表達(dá)所引起的代謝負(fù)擔(dān)。圖3蛋白質(zhì)的過(guò)度表達(dá)動(dòng)態(tài)的GLNAP2啟動(dòng)子完成高水平的表達(dá)和減少生長(zhǎng)延遲（A）來(lái)自于質(zhì)粒PS706○的PPS和P2AROG3GLNAP2AROG●的過(guò)度表達(dá)。宿主菌株是BW18302，它被單獨(dú)轉(zhuǎn)化為PAROG、P2AROG3或者沒(méi)有質(zhì)粒（▽?zhuān)＝臃N后的15小時(shí)，來(lái)自于每一個(gè)菌株的蛋白質(zhì)被分析，通過(guò)使用10的凝膠（合適的面板）SDS–PAGE。M凝膠跑道標(biāo)記蛋白質(zhì)的分子量顯示在凝膠上。貼標(biāo)簽的凝膠跑道’NONE’包含不帶質(zhì)粒BW18302，貼標(biāo)簽的凝膠跑道’PTAC’包含BW18302/PAROG細(xì)胞汁，貼標(biāo)簽的凝膠跑道’GLNAP2’包含BW18302/P2AROG3細(xì)胞汁（B）來(lái)自BW18302的PTACPPS（○）和GLNAP2PPS●的過(guò)度復(fù)制與沒(méi)有質(zhì)?？刂疲è?zhuān)┑谋容^。接種后的15小時(shí)，蛋白質(zhì)被分析，通過(guò)使用8的凝膠（合適的面板）SDS–PAGE。M凝膠跑道包含分子質(zhì)量標(biāo)志，貼標(biāo)簽的凝膠跑道’NONE’包含不帶質(zhì)粒的BW18302，貼標(biāo)簽的凝膠跑道’PTAC’BW18302/PPS706細(xì)胞汁，貼標(biāo)簽的凝膠跑道’GLNAP2’包含BW18302/PPS7番茄紅素路徑的動(dòng)力學(xué)控制當(dāng)避免生長(zhǎng)延遲時(shí)，由GLNAP2提供的動(dòng)力控制可以被用來(lái)提高特殊基因的表達(dá)水平。因此我們利用調(diào)節(jié)分子來(lái)重組細(xì)胞路徑以達(dá)到提高番茄紅素的生物合成，這樣可以擴(kuò)大在大腸桿菌中來(lái)自類(lèi)異戊二烯路徑的范圍。大腸桿菌中的類(lèi)異戊二烯利用丙酮酸鹽和G3P作為先驅(qū)，如圖4A所示。我們?cè)诖竽c桿菌中改造一個(gè)重組體番茄紅素路徑，通過(guò)表達(dá)基因等。這些基因DXS、GPS、CRTBI插入低拷貝質(zhì)粒PCL1920構(gòu)建質(zhì)粒PCW9，同時(shí)過(guò)量表達(dá)。在這個(gè)路徑里，GPS和IDI已經(jīng)被識(shí)別用來(lái)控制流量到最終產(chǎn)品。另外，我們已經(jīng)表明磷酸烯醇丙酮酸合成酶（PPS基因產(chǎn)物）控制丙酮酸鹽和G3P的平衡，從而也控制了到類(lèi)異戊二烯路徑的流量。為了有力的控制碳流量，我們使用GLNAP2啟動(dòng)子來(lái)控制GPS和IDI的表達(dá)。這些質(zhì)粒被單獨(dú)引入到包含PCW9的GLN菌株BW18302。如（圖5A）所示，P2IDI菌株GLNAP2IDI在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中26小時(shí)后生產(chǎn)出100MG/L的番茄紅素。另一方面包含PTACIDIPTACIDI的菌株，在相同的條圖4番茄紅素產(chǎn)品的代謝控制工程（A）用基因DXS、GPS、IDI和CRTBI、G3P、丙酮酸鹽、3磷酸鹽、IPP、PYR、DMAPP、二甲基二磷酸、FPP、GPP、GGPP等重建番茄紅素路徑（B）利用IDI和PPS的動(dòng)力學(xué)控制來(lái)改變代謝流量到番茄紅素路徑策略。兩種類(lèi)型的帶點(diǎn)線代表應(yīng)用到IDI和PPS（）和碳流量到番茄紅素路徑的變更（）的控制電路。GLC，葡萄糖；PEP，磷酸烯醇丙酮酸鹽；ACP，乙酰磷酸鹽；ACE，醋酸鹽；LYC、番茄紅素。件下僅生產(chǎn)出少量的番茄紅素。加之，P2IDI菌株生產(chǎn)的醋酸鹽比PTACIDI生產(chǎn)的少3倍，這表明到醋酸鹽的碳流量被改道到番茄紅素，如（圖5A）所示。PTACIDI菌株本身生產(chǎn)類(lèi)似的發(fā)酵樣品作為BW18302宿主控制，它暗示在這個(gè)菌株中番茄紅素的表達(dá)沒(méi)有改變代謝流量（圖5D）。這些結(jié)果被概括于表1。來(lái)自P2IDI菌株的丙酮酸鹽排泄物仍然很高，即使在大多數(shù)時(shí)間進(jìn)程中它少于PTACIDI生產(chǎn)的量（圖5C）。自從丙酮酸鹽成為類(lèi)異戊二烯路徑的先驅(qū)之一來(lái)自細(xì)胞內(nèi)代謝物的排泄指出碳仍然不能有效地轉(zhuǎn)移到番茄紅素。盡管如此，PPS過(guò)量表達(dá)在糖分解的條件下也可以引起生長(zhǎng)抑制（圖2B）。這樣為了避免代謝失衡PPS過(guò)量表達(dá)，最終的番茄紅素生產(chǎn)的菌株包含一個(gè)可以控制IDI和PPSGLNAP2IDIGLNAP2PPS的人造調(diào)節(jié)子，番茄紅素路徑的剩余物DXS,GPS,CRTBI在PTAC的控制下。番茄紅素的濃度增加50引起生產(chǎn)量增加三倍，從005MG/MLH到016MG/MLH如圖5A所示。這和他的包含PTACIDI和PPS184PTACIDIPTACPPS的菌株相對(duì)照，這種菌株沒(méi)有出現(xiàn)生長(zhǎng)延遲現(xiàn)象如圖5D示。明顯的，在GLNAP2調(diào)節(jié)子中的PPS再表達(dá)通過(guò)增加丙酮酸鹽的利用為番茄紅素增產(chǎn)創(chuàng)造了條件（如圖5C和表1所示）圖5通過(guò)ACP和GLNAP2的動(dòng)力學(xué)控制從大腸桿菌中提高番茄紅素的產(chǎn)量。（A）含有15的葡萄糖YE培養(yǎng)基中番茄紅素的產(chǎn)量。（B）乙酸的分泌物。（C）丙酮酸鹽的分泌物。（D）生長(zhǎng)活力這些結(jié)果表明由GLNAP2人造調(diào)節(jié)子提供的的動(dòng)力學(xué)控制允許速率控制酶的表達(dá)，這些酶用來(lái)幫助番茄紅素的生物合成。此外，這些結(jié)果為代謝工程提出一個(gè)有效的策略。而不是向過(guò)去那樣試圖刪除調(diào)整的回路，或者試圖通過(guò)過(guò)量表達(dá)關(guān)鍵酶來(lái)壓制他們。我們認(rèn)為，再某些情況下，代謝失衡可以通過(guò)合理的方式調(diào)整控制來(lái)處理。這種方法不僅可以最優(yōu)化代謝路徑，也可以修改對(duì)生物工藝學(xué)重要的細(xì)胞的活力。例如，細(xì)胞循環(huán)規(guī)則、蛋白質(zhì)置換和高水平蛋白質(zhì)產(chǎn)品。另外，他可能成為基因治療的重要手段，但是合理的控制電路設(shè)計(jì)擴(kuò)大路徑的雙重應(yīng)用將變成為一有效的設(shè)計(jì)工業(yè)應(yīng)用微生物的方法。實(shí)驗(yàn)方案材料所有的化學(xué)藥品來(lái)自SIGMASTLOUIS,MO修飾和限制酶來(lái)自生命工藝。所有的PCR相關(guān)材料來(lái)自PROMEGAMADISON,WI,寡核苷酸來(lái)自GENOSYSTHEWOODLANDS,TX。細(xì)菌菌株和質(zhì)粒大腸桿菌菌株BW13711LACX74ANDBW18302LACX74GLNL2001由密歇根大學(xué)ALEXNINFA友好提供。菌株VJS632K12PROTOTROPH由加利福尼亞大學(xué)DAVIS提供。菌株JCL1595和JCL1596通過(guò)把溶解的GLNAP2LACZ合在一起而構(gòu)建出來(lái)，用來(lái)構(gòu)建菌株JCL1595和JCL1596的質(zhì)粒PSR551和ΛRS45抗菌素由洛杉磯加利福尼亞大學(xué)BOBSIMON慷慨贈(zèng)送。質(zhì)粒PRW5TKT33和PJF118EH23分別由PALOALT和密芝根州立大學(xué)MICHAELBAGDASARIAN慷慨贈(zèng)送。質(zhì)粒PAROG通過(guò)克隆包含來(lái)自PRW5TKT的AROGFBR的PCR片段插入到PJF118EH的位點(diǎn)ECORIBAMHI而構(gòu)建，質(zhì)粒PTACIDI通過(guò)克隆包含來(lái)自大腸桿菌染色體的IDI的PCR片段到PJF118EH的位點(diǎn)ECORIPSTI而構(gòu)建質(zhì)粒PPS706已經(jīng)被描述。包含啟動(dòng)子和兩個(gè)NRI粘合位點(diǎn)的GLNAP2啟動(dòng)子區(qū)域是來(lái)自利用前導(dǎo)引物5?CAGCTGCAAAGGTCATTGCACCAAC和逆轉(zhuǎn)引物5?GGTACCAGTACGTGTTCAGCGGACATAC大腸桿菌染色體的PCR擴(kuò)增，這兩條引物放大了產(chǎn)生DNA序列在93和343之間位置的區(qū)域。包含GLNAP2啟動(dòng)子的PCR片段被克隆到質(zhì)粒PAROG、PPS706和PTACIDI的ECORVECORI位點(diǎn)以分別產(chǎn)生質(zhì)粒P2AROG3、PPSG706和P2IDI。質(zhì)粒PPS184和PPSG184通過(guò)切斷分別來(lái)自PPS706、PPSG706的PTACPPS、GLNAP2PPS片段、使用ECORVANDBAMHI以及插入到PACYC184相應(yīng)的位點(diǎn)而構(gòu)建。GLNAP2PCR片段被克隆到PRS551的位點(diǎn)ECORI，這樣就生產(chǎn)出含有GLNAP2的P2GFPUV。GLNAP2LACZ區(qū)域通過(guò)相同的重組被轉(zhuǎn)移到?RS45?以產(chǎn)生?P2GFPUV抗菌體。生長(zhǎng)條件??所有大腸桿菌菌株生長(zhǎng)在固定培養(yǎng)基的搖動(dòng)長(zhǎng)頸瓶中，培養(yǎng)液置于含有05葡萄糖的M9固定鹽或者含有15葡萄糖的YE固定鹽組成的中等培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。YE固定鹽由14G/LK2HPO4,、16G/LKH2PO4、5G/LNH42SO4、1GMGSO4和1MG/L硫胺組成。細(xì)胞混合物在550NM的波長(zhǎng)下被檢測(cè)。SDSPAGE和酶的分析LAEMMLI描述出SDSPAGE的草案，Β牛乳糖活力的測(cè)定由MILLER來(lái)完成。METABOLICCONTROLENGINEERINGTOIMPROVETHEPRODUCTIONOFECOLILYCOPENEWILLIAMRFARMERANDJAMESCLIAODEPARTMENTOFCHEMICALENGINEERING,UNIVERSITYOFCALIFORNIA,LOSANGELES,CA90034AUTHORLIAOJUCLAEDURECEIVED19990808,ACCEPTED20000222ABSTRACTSUMMARYOFMETABOLICENGINEERINGINCOMPLEXANDDIVERSEHOSTOFEXOGENOUSMETABOLITESHASMADEGRATIFYINGACHIEVEMENTSBUTTHEMETABOLICENGINEERINGAPPROACHMAINLYTOEXPANDTHENECESSARYENZYMESANDTHEDISCHARGEDCELFIGURE3PROTEINOVEREXPRESSIONTHEDYNAMICGLNAP2PROMOTERCOMPLETEDAHIGHLEVELOFEXPRESSIONANDREDUCEDGROWTHDELAYAFROMTHEOVEREXPRESSIONOFTHEPLASMIDPS706○PPSANDP2AROG3GLNAP2AROG●THEHOSTSTRAINBW18302,ITISINDIVIDUALLYTRANSFORMEDINTOPAROG,P2AROG3,ORNOPLASMID▽15HOURSAFTERINOCULATION,DERIVEDFROMASTRAINPROTEINISANALYZEDBYSDSPAGEUSING10GELSRIGHTPANELMARKERPROTEINHASAMOLECULARWEIGHTMGELRUNWAYISSHOWNONTHEGELLABELINGOFGEEXPERIMENTALPROGRAMMATERIALSALLCHEMICALSFROMSIGMASTLOUIS,MOMODIFICATIONANDRESTRICTIONENZYMEFROMTHELIFEPROCESSALLPCRRELATEDMATERIALSFROMPROMEGAMADISON,WI,OLIGONUCLEOTIDESFROMGENOSYSTHEWOODLANDS,TXBACTERIALSTRAINSANDPLASMIDSECOLISTRAINBW13711LACX74ANDBW18302LACX74GLNL2001BYALEXNINFAFRIENDLY,THEUNIVERSITYOFMICHIGANSTRAINSVJS632K12PROTOTROPHPROVIDEDBYTHEUNIVERSITYOFCALIFORNIA,DAVISSTRAINSJCL1595ANDJCL1596DISSOLV
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