白細(xì)胞介素10（IL-10）治療哮喘大鼠的機(jī)制及療效的研究.pdf

1、目的：不同劑量的外源性IL-10(interleukin-10)腹腔注射于SD大鼠哮喘模型，與地塞米松對(duì)照；通過(guò)觀察哮喘動(dòng)物的治療反應(yīng)，檢測(cè)肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid BALF)中嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophile granulocyte EOS)的百分計(jì)數(shù)，血清與BALF中IL-10、IgE濃度的變化，肺氣道炎癥及肺泡上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變；探討外源性IL-10對(duì)哮喘動(dòng)物模型的治療效果、合適

2、的劑量、可能存在的優(yōu)越性和毒副作用；目的是為外源性IL-10臨床治療哮喘的應(yīng)用價(jià)值提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1，實(shí)驗(yàn)對(duì)象為SD大鼠，健康的SPF級(jí)SD大鼠96只，雄性，月齡4～6周，體重180±20克； 2，哮喘動(dòng)物模型的復(fù)制：在實(shí)驗(yàn)第1天和第8天，用卵清蛋白(ovalbumin OVA)致敏SD大鼠，分別每只大鼠腹腔內(nèi)注射1m110％OVA凝膠，第15天開始霧化吸入1％卵清蛋白溶液激發(fā)，每天1次，每次2

3、0分鐘，反復(fù)激發(fā)7天，其中A組(正常對(duì)照組，致敏前隨機(jī)取6只)大鼠的腹腔注射及霧化吸入均用生理鹽水對(duì)照； 3，在實(shí)驗(yàn)第21天將已成功建立的哮喘動(dòng)物模型用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為5組(每組18只)：B組(哮喘對(duì)照組)，C組(地塞米松治療組)，D組(小劑量外源性IL-10治療組)，E組(中劑量外源性IL-10治療組)，F(xiàn)組(大劑量外源性IL-10治療組)，加上A組(正常對(duì)照組)共6組； 4，外源性給藥治療：實(shí)驗(yàn)第21天(霧化吸入

4、第7天)，在霧化吸入激發(fā)后，C組腹腔注射地塞米松0.4mg/kg，D組腹腔注射外源性IL-10 10pg/kg，E組腹腔注射外源性IL-10 40p/kg，F(xiàn)組腹腔注射外源性IL-10 80pg/kg，A、B組腹腔注射生理鹽水1ml； 5，提檢標(biāo)本：分別于注射藥物后12h、24h、48h(每組每時(shí)點(diǎn)取6只大鼠，其中A組只取12h)，用1％戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后開胸； ①直接右心室穿刺取血(每只取血量約6～8ml)，在4

5、℃冰箱中自然凝固后離心取血清，用各自ELISA試劑盒分別測(cè)定血清中IL-10、IgE濃度； ②結(jié)扎右主支氣管并取右肺中葉放入4％多聚甲醛固定液中，1周后送病理常規(guī)切片，觀察肺組織炎癥情況； ③取右肺中葉小塊組織(1mm3)，立即放入2％戊二醛中固定，送電鏡室切片，觀察肺組織超微結(jié)構(gòu)變化； ④經(jīng)氣管切口插管至左肺，用4ml生理鹽水反復(fù)灌沈左肺，回收BALF后離心，用各自ELISA試劑盒分別測(cè)定BALF上清液中IL-

6、10、IgE濃度，并取離心沉渣作細(xì)胞涂片，計(jì)算BALF中嗜酸性細(xì)胞(EOS)百分率；6，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((X)±S)表示，用SPSS11.5和Excel2000等統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果： 1，用OVA致敏并激發(fā)后，大鼠均出現(xiàn)呼吸急促、煩躁不安、腹式呼吸、唇爪紫紺、流涕等喘息癥狀。 2，注射藥物后地塞米松治療組與中劑量外源性IL-10治療組喘息癥狀均有明顯減輕，持續(xù)時(shí)間縮短，

7、外源性大劑量IL-10治療組則精神明顯萎靡、呼吸微弱、活動(dòng)進(jìn)食減少，外源性小劑量IL-10治療組喘息癥狀改善則不明顯。 3，BALF中EOS檢測(cè)結(jié)果： ①正常對(duì)照組BALF中偶見單核細(xì)胞和脫落上皮細(xì)胞； ②同時(shí)點(diǎn)比較，哮喘對(duì)照組EOS分類計(jì)數(shù)明顯高于地塞米松治療組及中劑量外源性IL-10治療組，P<0.01，表明中劑量外源性IL-10有下調(diào)BALF中EOS浸潤(rùn)的作用，小劑量外源性IL-10則無(wú)(P=0.636>0

8、.05)； ③大劑量外源性IL-10組BALF中見大量中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞和脫落上皮細(xì)胞。 4，肺組織病理變化：光鏡下 ①A組肺組織結(jié)構(gòu)正常，各級(jí)支氣管上皮完整、肺泡間隔正常、無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)； ②B組肺組織氣道粘膜水腫、粘膜皺壁增多、粘膜下及管周有大量EOS浸潤(rùn)、氣道上皮細(xì)胞脫落、管腔變窄、腔內(nèi)較多分泌物、肺泡內(nèi)可見紅細(xì)胞與中性粒細(xì)胞，符合哮喘的病理特征改變； ③C組與E組肺組織炎癥程度輕，氣道水腫

9、不明顯，氣道腔內(nèi)少量分泌物，無(wú)明顯EOS浸潤(rùn)； ④D組肺組織炎癥反應(yīng)類似B組，氣道壁仍水腫和EOS浸潤(rùn)，隨時(shí)間延長(zhǎng)炎癥改善也不明顯； ⑤F組肺氣道壁中多見中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道腔內(nèi)可見脫落上皮細(xì)胞及血性分泌物。 5，電鏡變化： ①A組肺泡間質(zhì)無(wú)異常，肺泡Ⅰ、Ⅱ型上皮細(xì)胞(tape Ⅰ alveolarepithelial AT-Ⅰ，tape Ⅱ alveolar epithelial AT-Ⅱ)形態(tài)及胞內(nèi)板

10、層體正常； ②B組肺泡間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，AT-Ⅰ、Ⅱ線粒體改變，纖毛脫落，AT-Ⅱ中板層體完全空泡化，D組空泡化減輕； ③C組及E組肺泡表面物質(zhì)層連續(xù)，AT-Ⅰ、Ⅱ正常，AT-Ⅱ中板層體空泡化程度輕； ④F組Ⅱ型上皮細(xì)胞脫落，板層體消失，纖毛變性，局部胞質(zhì)壞死。 6，ELISA檢測(cè)結(jié)果： ①B組BLAF中IL-10濃度比正常對(duì)照組低(P=0.001<0.01)，是負(fù)調(diào)節(jié)因子表明哮喘急性發(fā)作時(shí)，早期

11、給予外源性IL-10理論上有控制或緩解哮喘發(fā)作的作用； ②B、C、D、E組的BALF中IgE濃度明顯高于A組，表明藥物不能即刻緩解哮喘炎癥反應(yīng)，外源性IL-10也不例外； ③D組與C組同時(shí)點(diǎn)比較，PD12-C12=0.732>0.05，故小劑量外源性IL-10對(duì)哮喘大鼠氣道IgE的產(chǎn)生沒有抑制作用，而 E 組與同時(shí)點(diǎn) C 組比較，PE12-C12=0.048<0.05，PE48-C48=0.000<0.01，且E組各時(shí)點(diǎn)

12、BALF中IgE平均濃度均比C組低，表明中劑量外源性IL-10有調(diào)節(jié)哮喘發(fā)作時(shí)IgE分泌減少的作用，效應(yīng)比地塞米松更強(qiáng)； ④在E組，不同時(shí)點(diǎn)BALF中IL-10濃度均明顯升高(P=0.000<0.01)，且隨時(shí)間延長(zhǎng)濃度進(jìn)行性升高，沒有峰值PE24-12=0.877>0.05，PE48-24=0.022>0.01，表明適合劑量的外源性IL-10治療哮喘時(shí)比地塞米松更可能縮短病程； ⑤在哮喘速發(fā)相(12h)，B組血清中IL

13、-10濃度降低(P12=0.000<0.01)，IgE升高(P12=0.000<0.01)，表明血清中細(xì)胞因子(IL-10、IgE)可作為哮喘發(fā)作的判斷指標(biāo)； ⑥在E組，給予中劑量外源性IL-10后，血清中細(xì)胞因子IL-10、IgE濃度變化在速發(fā)相(12h)和遲發(fā)相(24h)與哮喘(B 組) 自然病程相反，血清中 IL-10 升高(PC12-B12=0.000<0.01，PE12-B12=0.000<0.01) ，而 IgE 降

14、低(PC12-B12=0.003<0.01，PE12-B12=0.012<0.05)，D組無(wú)此變化(與B組比較P=0.092>0.05)，說(shuō)明中劑量外源性IL-10具有細(xì)胞因子水平調(diào)節(jié)哮喘轉(zhuǎn)歸的作用； ⑦在E組的不同時(shí)點(diǎn)，血清IgE P48-24=0.800>0.05，血清IL-10 P24-12=0.281>0.05，P48-12=0.099>0.05，表明中劑量外源性IL-10對(duì)血清細(xì)胞因子IgE、IL-10的影響較短暫，治

15、療哮喘時(shí)可能要多次給藥，才能維持療效。 結(jié)論： 1，SD大鼠經(jīng)卵清蛋白反復(fù)致敏與激發(fā)后可建立理想的哮喘動(dòng)物模型； 2，合適劑量的外源性IL-10能調(diào)節(jié)哮喘氣道EOS的浸潤(rùn)，對(duì)哮喘大鼠的氣道炎癥有改善作用； 3，外源性IL-10對(duì)哮喘氣道細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)有負(fù)向調(diào)理作用，在緩發(fā)相，血清及BLAF中IL-10升高、IgE降低，促進(jìn)哮喘緩解，這可能是外源性IL-10對(duì)治療哮喘大鼠的一個(gè)重要機(jī)制，其效應(yīng)比地塞米松更強(qiáng)，