白樺鯊烯合酶和鯊烯環(huán)氧酶基因的克隆及表達(dá)特性研究.pdf

1、學(xué)校代碼：10225學(xué)號(hào)：S16322學(xué)位論文白樺鯊烯合酶和鯊烯環(huán)氧酶基因的克隆及表達(dá)特性研究指導(dǎo)教師姓名：申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：論文提交日期：授予學(xué)位單位：尹靜碩士張夢(mèng)巖東北林業(yè)大學(xué)2016年4月東北林業(yè)大學(xué)學(xué)科專業(yè)：論文答辯日期：授予學(xué)位日期：答辯委員會(huì)主席：論文評(píng)閱人：圣夕厶櫛案大學(xué)森林生物工程2016年6月2016年6月摘要摘要白樺三萜具有重要的抗腫瘤和艾滋病毒活性，而白樺三萜重要活性成分(白樺脂醇、齊墩果酸、達(dá)瑪烯二醇等)和固醇均來(lái)自

2、甲羥戊酸代謝途徑中共同的前體物質(zhì)2，3氧化角鯊烯。鯊烯合酶(Squalenesyn協(xié)ase，ss)和鯊烯環(huán)氧化酶(Squaleneepoxidase，SE)是直接參與合成2，3氧化角鯊烯的兩個(gè)關(guān)鍵酶，為三萜代謝途徑中的重要節(jié)點(diǎn)，SS和SE的含量和活性對(duì)三萜的合成與積累起著重要的調(diào)控作用。本研究以白樺(BetulaPlatyphllasue)為試材，克隆白樺三萜合成途徑關(guān)鍵酶BpSS和BpSE基因全長(zhǎng)及啟動(dòng)子序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析；檢

3、測(cè)了不同激素及不同組織中BpSS和BpSE表達(dá)模式；同時(shí)分別構(gòu)建了BpSS和BpSE的植物和酵母表達(dá)載體，對(duì)其在白樺和酵母中的表達(dá)特性進(jìn)行研究，并完成基因定位。以期為為通過(guò)基因工程技術(shù)及合成生物學(xué)途徑促進(jìn)白樺三萜高效合成奠定基礎(chǔ)，為白樺三萜類物質(zhì)的生物技術(shù)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。本研究結(jié)果如下：1以白樺組培苗RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，應(yīng)用RACE技術(shù)克隆獲得白樺的鯊烯合酶BpSS和鯊烯環(huán)氧酶BpSE基因的cDNA全長(zhǎng)，生物信息學(xué)分

4、析表明，BpSS基因cDNA全長(zhǎng)為1588bp，ORF為1242bp，編碼413個(gè)氨基酸，有一個(gè)特異的Isoprenoid超家族，包含結(jié)構(gòu)域，并與大豆、甘草等物種船BiosynC1TransIPPSHH的氨基酸序列相似性達(dá)85～88％，具有高度同源性。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，白樺的冊(cè)與可可樹(shù)的SSl同源性較高，屬于一個(gè)分支，次之是豆科的甘草和大豆等，再次之是毛果楊。白樺的肥基因cDNA全長(zhǎng)為2040bp，ORF長(zhǎng)為1581bp，編碼526個(gè)

5、氨基酸，在第209428aa位置具有一個(gè)SDR超家族，包含特異的鯊烯環(huán)氧酶結(jié)構(gòu)域(SE)保守區(qū)和輔酶Q結(jié)合域(COQ6)，與可可、麻風(fēng)樹(shù)等物種胚的氨基酸序列相似性達(dá)82～88％。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明，白樺的艇與南非醉茄、毛曼陀羅的同源性較高，屬于一個(gè)分支，與其他植物、動(dòng)物和人的進(jìn)化距離依次漸遠(yuǎn)。2利用實(shí)時(shí)定量RTPCR技術(shù)，分析了不同組織中以及不同植物激素誘導(dǎo)下BpSS和BpSE基因的表達(dá)模式，結(jié)果表明，BpSS和BpSE基因均存在組織表達(dá)特

6、異性，且表達(dá)特征相似，均為葉莖根。MeJA(100tM)、乙烯(5mM)和ABA(109M)不同程度誘導(dǎo)了BpSS和BpSE的表達(dá)。卻鼴和BpSE的表達(dá)對(duì)SA(50mg／L)響應(yīng)不顯著。構(gòu)建高效植物表達(dá)載體pCAMBIAl303BpSS采用三親雜交的方法，通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)，將BpSSGFP融合蛋白轉(zhuǎn)化到洋蔥表皮細(xì)胞使其瞬時(shí)表達(dá)，結(jié)果顯示，在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)出綠色熒光，表明BpSS蛋白的表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)中。3利用基因組步移技術(shù)，克隆獲得長(zhǎng)度為9