尼可地爾通過(guò)調(diào)節(jié)硫氧還蛋白的表達(dá)減輕臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激.pdf

1、第一部分H2O2誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的建立及評(píng)價(jià)
　　目的：用H202建立臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的模型,并對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　方法：將臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分為6組:正常組,陽(yáng)性對(duì)照組,50μmol/LH2O2組,100μmol/LH2O2組,200μmol/LH2O2組,400μmol/LH2O2組。細(xì)胞氧化應(yīng)激模型建立方法:按照上述的分組及H2O2濃度,分別放于培養(yǎng)箱中6h,12h,24h,正常組加入相同體積的1×P

2、BS。然后用DCFH-DA探針裝載后于熒光顯微鏡下直接觀察細(xì)胞中的ROS熒光,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量。
　　結(jié)果：H2O2可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的生成,不同濃度的H2O2作用不同的時(shí)間,臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的ROS生成量也不同,在24h時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激達(dá)到高峰,并且隨著H2O2刺激濃度的升高,細(xì)胞內(nèi)的ROS呈先增高后降低的趨勢(shì),在H2O2濃度為100μmol/L時(shí)作用最為顯著,隨后細(xì)胞內(nèi)ROS逐漸減少,細(xì)胞壞死率比例上升

3、。熒光圖片與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的結(jié)果一致。
　　結(jié)論：100μmol/LH2O2與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在37℃,5％CO2培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)24小時(shí),可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧含量顯著升高,成功建立臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型。
　　第二部分尼可地爾對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的影響
　　目的：觀察尼可地爾對(duì)氧化應(yīng)激細(xì)胞模型內(nèi)活性氧形成以及參與細(xì)胞內(nèi)氧化還原關(guān)鍵的蛋白質(zhì)家族之一——硫氧還蛋白表達(dá)的影響
　　方法：臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分為四大組:①正

4、常臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞組,②氧化應(yīng)激模型組,③尼可地爾+氧化應(yīng)激模型組,④尼可地爾+氧化應(yīng)激模型+格列苯脲組。以上各組均在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí),采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中ROS的含量,分別使用RT-PCR和Western-Blot方法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)硫氧還蛋白mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　結(jié)果：尼可地爾可以減少臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中活性氧的形成,同時(shí)細(xì)胞內(nèi)硫氧還蛋白的量有相應(yīng)變化;鉀離子通道阻斷劑格列苯脲可以阻斷