毛囊干細胞和表皮干細胞生物學特性的比較研究.pdf

1、目的：
　　1、建立高效、快速的兔FSCs(Folliclestemcells，F(xiàn)SCs)和ESCs(Epidermalstemcells，ESCs)分離、培養(yǎng)技術，進行原代與傳代細胞的培養(yǎng)。2、觀察體外培養(yǎng)的兔FSCs和ESCs生物學特征、細胞周期，并比較兩種細胞的差異。3、體外分離、培養(yǎng)人FSCs和ESCs，進行形態(tài)學觀察。4、比較人FSCs和ESCs生物學特征。探討更合適組織工程皮膚的種子細胞，為體外構建含有附屬器官的人工皮

2、膚和實現(xiàn)大面積皮膚損傷從結構修復到功能重建提供基礎。
　　方法：
　　1、采用兩步酶消化法從兔觸須部和腹部皮膚分別獲取FSCs和ESCs，進行原代與傳代培養(yǎng)，用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)。
　　2、免疫組化檢測兔FSCs和ESCs的表面標記物，β1整合素和角蛋白19(keratin19，K19)的表達差異。用MTT法考察FSCs和ESCs增殖活性。
　　3、采用流式細胞儀分析兔的第5代和第15代FSCs和ESCs

3、各周期細胞的分布；比較經(jīng)傳代后兩種細胞的生物學活性。
　　4、用熒光定量PCR技術檢測傳代培養(yǎng)的FSCs和ESCsK19，β1整合素在：mRNA水平上的表達差異。
　　5、采用單細胞法和組織塊法培養(yǎng)，分離培養(yǎng)人頭皮來源的FSCs；分離培養(yǎng)人皮膚的ESCs，進行原代和傳代細胞形態(tài)學觀察。
　　6、比較人FSCs和ESCs體外貼壁時間、細胞形態(tài)結構、生長曲線和細胞增殖活性的差異。
　　結果：
　　1、采用兩步酶

4、法成功地分離出兔的FSCs和ESCs，F(xiàn)SCs分離培養(yǎng)2天開始有細胞貼壁，3天時貼壁的細胞有明顯的聚集傾向，7天后克隆增大開始融合，傳代培養(yǎng)的FSCs貼壁迅速，細胞培養(yǎng)8天達到完全融合。ESCs培養(yǎng)10天細胞才有克隆樣生長趨勢；傳代培養(yǎng)細胞貼壁緩慢，細胞培養(yǎng)2周80％融合。
　　2、免疫組化染色結果顯示，兔FSCs和ESCsβ1整合素、K19免疫染色均陽性表達。FSCs和ESCs生長曲線的比較除第2天無明顯的差異外，從第6天開始F

5、SCs的增殖活性明顯高于ESCs，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，第10、14、18天FSCs的增殖活性逐漸增強，直到第26天，增殖活性開始下降；ESCs在第10天達到了增殖最高峰后細胞增殖活性迅速下降。FSCs顯示出持續(xù)高增殖，其高增殖時間是ESCs的2倍。
　　3、流式細胞儀分析細胞周期結果顯示，傳代培養(yǎng)的FSCs和ESCs隨代次延長S期百分比和PI值均有下降，同代次細胞FSCsPI值大于ESCs。
　　4、熒光定量PC

6、R檢測兔FSCs和ESCs的β1整合素和K19基因表達，顯示FSCsβ1整合素和K19mRNA表達明顯高于ESCs。
　　5、“兩步酶”分離法可獲取大量人FSCs和ESCs；單細胞培養(yǎng)FSCs細胞大部分在24h內貼壁，傳代細胞增殖迅速，3天左右達到80％以上融合。組織塊培養(yǎng)5天可見細胞在組織周圍爬出，細胞呈表皮樣。生長迅速，15天時可見表皮樣細胞周圍出現(xiàn)成纖維樣的細胞。ESCs培養(yǎng)3天時細胞多懸浮生長。傳代細胞增殖緩慢，培養(yǎng)7天細

7、胞達到80％融合。
　　6、人FSCs和ESCsβ1整合素、K19免疫染色均陽性。FSCs與ESCs生長曲線相比，F(xiàn)SCs具有更高的增殖活性且有一個相對較長高增殖活性的生長期。
　　結論：
　　1、“兩步酶”消化法是一種安全、高效的FSCs和ESCs的分離方法?？稍谳^短時間內為實驗研究提供大量目標細胞。
　　2、人和兔來源的FSCs與ESCs均表達表皮干細胞標志β1整合素和K19，且FSCs顯示高表達。