酵母線粒體β-酮酰-ACP還原酶的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究.pdf

1、脂肪酸是自然界中極為重要的一類疏水性分子，在細(xì)胞內(nèi)扮演著多種多樣的角色。細(xì)菌、植物和動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)都擁有各自的脂肪酸合成體系，負(fù)責(zé)以乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A作為原料的從頭合成。有兩種類型的合成酶系統(tǒng)，Ⅰ型脂肪酸合成酶存在于脊椎動(dòng)物、酵母細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)以及一些細(xì)菌中，該酶只含一條或者兩條龐大的多個(gè)結(jié)構(gòu)域的多功能肽鏈。Ⅱ型脂肪酸合成酶存在于植物和大多數(shù)細(xì)菌中，是由不同基因編碼多種不同的酶參與整個(gè)合成反應(yīng)。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母線粒體中存在著Ⅱ型

2、脂肪酸合酶。而針對(duì)該條合成代謝中各個(gè)反應(yīng)來(lái)說(shuō)，共計(jì)有六種基因參與編碼這些酶，分別是ACP1，CEM1，MCT1，HTD2，ETR1和OAR1。其中OAR1基因負(fù)責(zé)編碼線粒體β-酮酰-ACP還原酶(YmtOAR1)，研究表明刪除酵母細(xì)胞中的該基因直接導(dǎo)致呼吸缺陷型表型及生長(zhǎng)的抑制。此外，線粒體中的脂肪酸合成體系被證明與tRNA的加工過(guò)程息息相關(guān)。
　　 YmtOAR1屬于SDR(short-chain alcohol dehydr

3、ogenase)蛋白家族，與其他物種的同源蛋白(FabG)存在20％-30％的同源性。但不同的是，一級(jí)序列中的插入序列及C-末端的缺失，導(dǎo)致了整體結(jié)構(gòu)并沒(méi)有呈現(xiàn)經(jīng)典的Rossmann折疊花樣，在溶液中呈現(xiàn)獨(dú)特的二聚體聚合狀態(tài)。YmtOAR1以輔酶NADPH作為負(fù)氫供體，通過(guò)質(zhì)子傳遞，催化底物還原。本論文的研究工作解析了2.6(A)分辨率的apo-YmtOAR1晶體結(jié)構(gòu)以及兩套含有輔酶NADPH復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)分析表明，YmtOAR

4、1與所有已報(bào)道的同源蛋白有著明顯的結(jié)構(gòu)差異;且這種差異也從一定角度闡明了聚集狀態(tài)與同源蛋白不同的原因。同時(shí)，YmtOAR1在結(jié)合輔酶后的構(gòu)象發(fā)生了較為顯著的變化，并且兩套含配體的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)顯示NADPH的構(gòu)象亦略有不同。三套晶體結(jié)構(gòu)可以用來(lái)模擬輔酶進(jìn)入酶活口袋的動(dòng)態(tài)過(guò)程。此外，在結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上，通過(guò)定點(diǎn)突變和酶活性檢測(cè)，確定了輔酶識(shí)別的關(guān)鍵殘基Arg14，該殘基對(duì)于輔酶識(shí)別酶是極其重要的，該殘基的突變直接導(dǎo)致酶活性的喪失和極大地降

5、低了酶對(duì)輔因子的親和力。對(duì)于YmtOAR1的結(jié)構(gòu)解析無(wú)疑拓展了我們對(duì)SDR家族蛋白豐富性的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，同時(shí)對(duì)更深入理解酶促反應(yīng)機(jī)制提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　 真核生物的內(nèi)膜系統(tǒng)極為發(fā)達(dá)，不但區(qū)分了各種生化反應(yīng)所發(fā)生的場(chǎng)所，也提供了各種細(xì)胞器之間的物質(zhì)交流模式——囊泡運(yùn)輸。轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡包裹貨物分子，在一些特殊蛋白的輔助下，與特定的靶膜融合，從而完成對(duì)貨物分子的篩選和運(yùn)輸。在SNARE和Sorting Nexins這兩種蛋白家族的協(xié)助下，囊

6、泡經(jīng)過(guò)出芽或融合，后經(jīng)分揀和運(yùn)輸，抵達(dá)靶位點(diǎn)。
　　 存在于釀酒酵母細(xì)胞高爾基體到晚期溶酶體分揀途徑中的重要蛋白Mvp1，是一個(gè)較為特殊的Sorting Nexins蛋白。MVP1基因與VPS1基因存在一定的聯(lián)系性，過(guò)量表達(dá)Mvp1蛋白可抑制VPS1的幾個(gè)等位基因。關(guān)于Mvp1蛋白參與囊泡分揀過(guò)程的機(jī)制目前還未闡明。本項(xiàng)研究結(jié)晶了Mvp1蛋白部分片段（⊿N117-Mvp1），嘗試解析晶體結(jié)構(gòu)，但由于衍射分辨率較低，故相應(yīng)的優(yōu)化工