剪切因子FBP21雙WW結(jié)構(gòu)域的溶液結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能研究.pdf

1、在真核細(xì)胞中，編碼基因的表達(dá)是基因經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄、mRNA加工、翻譯、產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)的復(fù)雜過(guò)程。這些過(guò)程通過(guò)龐大而精細(xì)的核酸-核酸，核酸-蛋白，蛋白-蛋白相互作用彼此密切關(guān)聯(lián)，形成高度精密的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其中前體mRNA的剪切在細(xì)胞核中由剪切體復(fù)合物催化完成的。剪切體是由5個(gè)小核RNAs和幾百種蛋白質(zhì)組成的高度動(dòng)態(tài)變化的核糖核蛋白顆粒。小核糖核蛋白顆粒(snRNPs)和大量的蛋白因子是形成有活性的剪切體所必需的。在芽殖酵母中，剪切

2、因子Prp40通過(guò)和剪切分支點(diǎn)蛋白BBP以及U5 snRNP蛋白Prp8相互作用在前體mRNA剪切過(guò)程中起內(nèi)含子兩端的搭橋作用。Prp40通過(guò)2個(gè)WW結(jié)構(gòu)域與5'端剪切位點(diǎn)和BBP相互作用拉近了5'端剪切位點(diǎn)和分支點(diǎn)的空間距離從而起到了建立橋梁的作用。這種相互作用被認(rèn)為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是保守的。FBP21(formin binding protein21)，是人源的Prp40相似蛋白，含有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)和兩個(gè)連續(xù)的第Ⅲ類(lèi)WW結(jié)構(gòu)域，是剪切

3、體A/B復(fù)合物的組分，是U2小核糖核蛋白顆粒(snRNPs)中的蛋白質(zhì)。FBP21和剪切因子SC35以斑點(diǎn)狀共定位在細(xì)胞核內(nèi)，這種細(xì)胞核斑點(diǎn)是剪切因子在細(xì)胞核內(nèi)的存儲(chǔ)位點(diǎn)。此外，F(xiàn)BP21與剪切因子U1 snRNP蛋白U1C，核心snRNPs蛋白SmB/SmB'以及分支點(diǎn)蛋白SF1/BBP都有相互作用。這些信息都暗示了FBP21在前體mRNA剪切中有著重要作用，但是目前還沒(méi)有明確剪切相關(guān)功能的研究報(bào)道。
　　 在本工作中，我們通

4、過(guò)三維核磁共振(NMR)波譜學(xué)的方法解析了人源剪切體蛋白FBP21雙WW結(jié)構(gòu)域的溶液結(jié)構(gòu)。這是第一個(gè)被解析的第Ⅲ類(lèi)WW結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的報(bào)道。雙WW結(jié)構(gòu)域的溶液結(jié)構(gòu)顯示兩個(gè)WW結(jié)構(gòu)域間的相對(duì)取向不是固定的，而是具有一定的相對(duì)運(yùn)動(dòng)。通過(guò)NMR骨架弛豫動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)和殘留偶極耦合實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)兩個(gè)WW結(jié)構(gòu)域的連接區(qū)域具有高度的柔性，這種柔性使得兩個(gè)WW結(jié)構(gòu)域間具有相互運(yùn)動(dòng)。我們用化學(xué)位移干擾實(shí)驗(yàn)和等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)(ITC)分析了FBP21兩個(gè)WW結(jié)構(gòu)

5、域的配體識(shí)別特性和相互作用界面。結(jié)果顯示，兩個(gè)WW結(jié)構(gòu)域在結(jié)合配體的時(shí)候有合作，這種結(jié)構(gòu)域間的合作將FBP21雙WW結(jié)構(gòu)域?qū)ε潴w的親和力提高了約60倍，而且這種合作需要兩個(gè)WW結(jié)構(gòu)域間的柔性連接區(qū)域參與協(xié)助。盡管已經(jīng)有不少單個(gè)WW結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)被解析，但是已解析的雙WW結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)目前只有2個(gè)，而且這兩個(gè)結(jié)構(gòu)功能差異很大。作為第三個(gè)被解析得雙WW結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，我們的研究顯示盡管有高度相似的序列和結(jié)構(gòu)域排列，不同蛋白中的雙WW結(jié)構(gòu)域的相互作用機(jī)理

6、，相對(duì)空間取向和動(dòng)力學(xué)特征以及其生物學(xué)功能可以是完全不同的。
　　 我們進(jìn)一步研究了FBP21及其雙WW結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)功能。首次報(bào)道了FBP21是一個(gè)剪切因子，通過(guò)兩個(gè)第Ⅲ類(lèi)的WW結(jié)構(gòu)域有效的激活in vivo前體mRNA的剪切。在激活前體mRNA剪切過(guò)程中，兩個(gè)WW結(jié)構(gòu)域必須同時(shí)參與，缺一不可。任何一個(gè)WW結(jié)構(gòu)域的突變就會(huì)徹底破壞FBP21激活剪切的功能。同時(shí)，WW結(jié)構(gòu)域間的連接區(qū)域也是很重要，縮短這一區(qū)域會(huì)嚴(yán)重影響FBP21

7、的剪切功能。GSTpull down和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分別用于研究FBP21與剪切因子SIPP1的in vitro和in vivo相互作用。我們還用免疫熒光的方法研究了FBP21在細(xì)胞內(nèi)的定位以及和剪切因子SC35共定位的情況。結(jié)果顯示，F(xiàn)BP21與SIPP1的相互作用，在細(xì)胞內(nèi)的定位同樣都需要兩個(gè)WW結(jié)構(gòu)域同時(shí)參與，缺一不可。FBP21的各種生物學(xué)功能都需要兩個(gè)WW結(jié)構(gòu)域同時(shí)參與合作，并且這種合作需要其連接區(qū)域的柔性才能實(shí)現(xiàn)。這可以用我