適于復(fù)雜生物體系的功能核酸熒光納米探針的研究.pdf

1、實(shí)時(shí)監(jiān)控細(xì)胞內(nèi)生物分子的濃度變化和分布情況對(duì)于研究其生理和病理功能、鑒定疾病生物標(biāo)志物以及疾病的早期診斷具有非常重要的意義。基于熒光探針的熒光成像技術(shù)因具有靈敏度高、能夠?qū)崿F(xiàn)時(shí)空分辨成像、對(duì)活細(xì)胞和組織損傷小等優(yōu)點(diǎn)，已成為監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)生物分子的強(qiáng)有力研究工具。然而，傳統(tǒng)的熒光探針進(jìn)入細(xì)胞的低效率制約著其在細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)用。同時(shí)，目前的熒光分析技術(shù)大都基于單光子熒光探針實(shí)現(xiàn)，其具有一些內(nèi)在的缺點(diǎn)，比如光漂白效應(yīng)、細(xì)胞或組織自身熒光干擾以及穿透深

2、度淺等?；陔p光子熒光探針的雙光子成像技術(shù)是利用頻率及能量較低的（波長(zhǎng)較長(zhǎng)）的雙光子作為激發(fā)光源的一種新技術(shù)，它能夠減少光散射，降低生物自身背景熒光的干擾，實(shí)現(xiàn)深層組織的長(zhǎng)時(shí)間觀測(cè)以及提供更好的三維空間定位能力，減少對(duì)組織的損傷。這些優(yōu)點(diǎn)使得雙光子熒光探針更適合用于復(fù)雜生物體系的研究。
　　功能核酸主要包括兩大類具有特異性分子識(shí)別功能的核酸分子，一類是具有類似于蛋白酶的催化活性、特異性依賴輔助因子而發(fā)揮催化作用的分子，稱為脫氧核酶

3、(DNAzymes)；另一類是能夠像抗體一樣特異性識(shí)別目標(biāo)物包括金屬離子、小分子、藥物、蛋白甚至是整個(gè)細(xì)胞的核酸分子，稱為核酸適配體(Aptamers)。功能核酸具有結(jié)合力強(qiáng)、選擇性好、靶標(biāo)范圍廣、生物相容性好、易合成和易功能化修飾等優(yōu)點(diǎn)；因此，功能核酸的出現(xiàn)為構(gòu)建用于復(fù)雜生物體系的熒光探針提供了新的分子識(shí)別工具。納米材料，比如金納米顆粒、量子點(diǎn)、上轉(zhuǎn)換納米顆粒、DNA納米材料、介孔二氧化硅以及二氧化錳納米片等具有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)、較高的

4、細(xì)胞膜穿透能力、優(yōu)良的生物相容性以及較大的負(fù)載能力。同時(shí)，由于納米技術(shù)的飛速發(fā)展，納米材料的合成和表征技術(shù)已取得了巨大的進(jìn)展。因此結(jié)合功能核酸和納米技術(shù)構(gòu)建的熒光納米探針在復(fù)雜生物體系研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　為了解決現(xiàn)有熒光探針生物穩(wěn)定性差、膜穿透能力弱、成像效果不佳等導(dǎo)致其難以用于復(fù)雜生物體系的問(wèn)題，本論文利用雙光子熒光成像技術(shù)和納米材料的優(yōu)勢(shì)，將核酸分子工程技術(shù)與納米技術(shù)結(jié)合，開(kāi)發(fā)了一系列適于復(fù)雜生物體系的功能核酸熒光

5、納米探針。具體內(nèi)容如下：
　?。?）在第2章中，基于鋯離子與兩個(gè)磷酸根的特異性配位能力，我們構(gòu)建了一種通過(guò)目標(biāo)誘導(dǎo)形成分子信標(biāo)的熒光增強(qiáng)型探針用于鋯離子的檢測(cè)。由于分子信標(biāo)獨(dú)特的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)以及γ-環(huán)糊精的放大作用，使得該探針具有較低的檢測(cè)下限。進(jìn)一步將該探針用于實(shí)際樣品湘江水中鋯離子的檢測(cè)，結(jié)果令人滿意。
　　（2）在第3章中，基于DNA樹枝狀納米結(jié)構(gòu)作為一種高效的運(yùn)輸載體，我們構(gòu)建了一種納米探針用于功能核酸的細(xì)胞輸送和細(xì)胞

6、內(nèi)生物分子的原位實(shí)時(shí)檢測(cè)。該納米探針在細(xì)胞內(nèi)維持了DNA酶原有的催化活性和核酸適配體對(duì)目標(biāo)物的特異性識(shí)別能力。同時(shí)，這種 DNA樹枝狀納米載體具有較好的生物相容性、較高的細(xì)胞膜穿透能力以及較高的生物穩(wěn)定性，因此，該納米探針在生物醫(yī)學(xué)診斷和治療領(lǐng)域擁有廣闊的應(yīng)用前景。
　　（3）目前，基于熒光探針的熒光成像技術(shù)大多是通過(guò)單光子激發(fā)實(shí)現(xiàn)的，不可避免地會(huì)出現(xiàn)光漂白效應(yīng)、細(xì)胞或組織自身熒光干擾以及組織穿透深度淺等問(wèn)題。在第4章中，基于雙光

7、子成像技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)深層組織的長(zhǎng)時(shí)間觀測(cè)、背景熒光干擾小、光散射小以及對(duì)樣品損傷小等優(yōu)點(diǎn)，我們構(gòu)建了一種熒光增強(qiáng)型納米探針用于谷胱甘肽的檢測(cè)。結(jié)合雙光子成像技術(shù)，該探針可成功用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞和組織內(nèi)谷胱甘肽含量的變化，證實(shí)了該探針在生物系統(tǒng)中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
　?。?）基于雙光子成像技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，以及核酸適配體特異性結(jié)合目標(biāo)細(xì)胞的能力，在第5章中，我們構(gòu)建了一種多功能納米探針用于高對(duì)比度的雙模式細(xì)胞成像和腫瘤的診療。在該納米探針中，雙