國(guó)產(chǎn)石杉科藥用植物的分子生物學(xué)研究.pdf

1、石杉科(Huperziaceae)植物是一類多年生小型草本植物，土生、附生或生于苔蘚叢中，直立或下垂生長(zhǎng)，喜陰涼潮濕環(huán)境。近年來(lái)隨著對(duì)石杉科植物的開(kāi)發(fā)和利用，使得石杉科植物資源逐漸減少。因此，對(duì)石杉科植物資源有效的合理保護(hù)與科學(xué)的開(kāi)發(fā)利用工作己迫在眉睫。本文針對(duì)這一狀況，為了解決石杉科藥用植物的資源匱乏問(wèn)題，保證石杉科藥用植物資源的可持續(xù)開(kāi)發(fā)和利用，進(jìn)行設(shè)計(jì)和研究。本論文首先對(duì)我國(guó)的石杉科植物的生態(tài)狀況、資源情況、分類情況以及石杉?jí)A甲在

2、石杉科植物中的分布、研究狀況、藥理作用等作了詳細(xì)的分析和描述，并著重進(jìn)行如下研究。 1．對(duì)石杉科植物的分子生物學(xué)研究利用基因組學(xué)對(duì)石杉科藥用植物進(jìn)行研究。通過(guò)對(duì)不同種石杉科植物的總DNA的提取，選擇葉綠體基因rbcL，rpL16，matK及psbA-trnH間區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，通過(guò)序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果闡明了石杉科植物系統(tǒng)位置和分類關(guān)系。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中石杉科與石蔥屬Phylloglosum位于系統(tǒng)樹(shù)的姊妹枝，

3、共同組成的進(jìn)化枝與石松科Lycopodiaceae植物平行排列，這一結(jié)果與形態(tài)學(xué)上的分類方法是一致的，支持了將石杉科獨(dú)立于石松科植物的分類觀點(diǎn)。對(duì)石杉科的屬下分類，系統(tǒng)進(jìn)化拓?fù)錁?shù)表明，該科植物中明顯的包含了兩個(gè)進(jìn)化枝，即石杉屬植物進(jìn)化枝和馬尾杉屬植物進(jìn)化枝，這一結(jié)果提示了石杉科植物中兩個(gè)屬的劃分的正確性，確立了石杉科植物的系統(tǒng)分類關(guān)系，即石杉屬Huperzia與馬尾杉屬Phlegmariurus的分類方法。這一方法與形態(tài)學(xué)的分類方法相輔

4、相成，這一結(jié)果是對(duì)于捷克植物學(xué)家Holub對(duì)該屬分類的不確定性的有力的答復(fù)。并對(duì)屬下的分類做了進(jìn)一步的研究，系統(tǒng)樹(shù)上石杉屬中石杉組和小杉蘭組的植物明顯地被分為兩個(gè)聚群，這一結(jié)果同張麗兵、孔憲需的分類學(xué)觀點(diǎn)相一致。由于馬尾杉屬的供試材料不足，其屬內(nèi)系統(tǒng)演化結(jié)果尚不明朗，有待于進(jìn)一步的研究。本研究還確立了長(zhǎng)柄石杉應(yīng)為蛇足石杉的一個(gè)變種，這一觀點(diǎn)得到了系統(tǒng)樹(shù)的支持。伏貼石杉雖然與小杉蘭在形態(tài)學(xué)上很難區(qū)分，在系統(tǒng)樹(shù)上該兩種植物分別聚于不同的演化

5、枝，并有很高的Bootstrap支持率，這一結(jié)果可以明顯的把小杉蘭和伏貼石杉區(qū)分開(kāi)，伏貼石杉應(yīng)該為一個(gè)獨(dú)立的種。 通過(guò)對(duì)不同基因序列比對(duì)并通過(guò)遺傳距離及堿基差異的分析，表明了石杉科植物之間存在一定的差別，特別是屬間有較大的差別，為屬間鑒定提供了重要的鑒定依據(jù)。一些形態(tài)上相似難以鑒定的種，如蛇足石杉與長(zhǎng)柄石杉；東北石杉、伏貼石杉和小杉蘭之間可以通過(guò)堿基差異及遺傳距離的不同進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，為石杉科植物在分子鑒定提供了簡(jiǎn)便、可靠的鑒定

6、方法。 2．進(jìn)行了兩種石杉科植物蛋白質(zhì)表達(dá)譜的研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)石杉科藥用植物進(jìn)行了研究。為探討石杉科植物中主要有效活性成分石杉?jí)A甲生物合成的途徑奠定了基礎(chǔ)。分析比較了石杉?jí)A甲含量差別較大的東北石杉和伏貼石杉中的蛋白質(zhì)的2-DE表達(dá)譜，優(yōu)化了從石杉科植物中提取純化蛋白質(zhì)的方法。從東北石杉的蛋白質(zhì)表達(dá)譜中分離出蛋白質(zhì)斑點(diǎn)1338個(gè)，從伏貼石杉中分出蛋白質(zhì)斑點(diǎn)1269個(gè)。273個(gè)差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)多集中在分子量在15-75KDa和

7、pH4-7之間。通過(guò)對(duì)137個(gè)成功獲取的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的鑒定，有60個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)鑒定成功。其中在有貢獻(xiàn)的16個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)中，斑點(diǎn)Ha22號(hào)蛋白質(zhì)存在于石杉?jí)A甲含量高的伏貼石杉中，而不含石杉?jí)A甲的東北石杉中無(wú)此斑點(diǎn)，該蛋白質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)為一種絲裂原調(diào)節(jié)蛋白：Mrp3，而在植物體內(nèi)該蛋白質(zhì)的作用機(jī)理尚不清楚，由于該蛋白質(zhì)是存在于兩種石杉?jí)A甲含量明顯不同，但生長(zhǎng)環(huán)境和形態(tài)相似的兩個(gè)種中的明顯差別蛋白質(zhì)，它的存在有可能與石杉?jí)A甲的生源途徑有一定的相關(guān)

8、性，因而改變了不同的石杉科植物中的石杉?jí)A甲的含量的高低。另外的15個(gè)蛋白質(zhì)在兩個(gè)種都存在著差異，表明，這些有差異的蛋白質(zhì)都有可能參與了石杉?jí)A甲的生物合成途徑。以上結(jié)果還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)為尋找參與石杉?jí)A甲合成的功能基因或蛋白質(zhì)提供了重要的參考資料。該研究將為對(duì)石杉科藥用植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑以及與基因和蛋白質(zhì)的關(guān)系的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 本文研究在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，屬國(guó)際首創(chuàng)。該研究為中藥植物資源的合理開(kāi)