甜菜M14品系特異表達(dá)基因M14-263在模式植物中的表達(dá)研究.pdf

1、甜菜M14品系是由栽培甜菜(Beta uvlgaris L.)與四倍體白花甜菜(Beta corolliflora Zoss.)種間雜交，進(jìn)一步回交獲得的甜菜無融合生殖單體附加系。甜菜M14品系染色體組除了含有18條栽培甜菜染色體外，還附加有一條白花甜菜第9號染色體，附加染色體的傳遞率高達(dá)96.5％。研究甜菜M14品系中的特異表達(dá)基因，能夠為解釋甜菜M14品系特殊的生殖方式提供直接的分子生物學(xué)證據(jù)，從而使我們對甜菜M14品系優(yōu)良性狀的研

2、究具有更高的價值和意義。 實驗室前期工作中，以栽培甜菜為對照，已從甜菜M14品系中得到298個特異的ESTS，并已全部進(jìn)行了測序和生物信息學(xué)分析；同時利用RACE技術(shù)從甜菜M14品系的298個ESTs中得到了甜菜M14品系9個特異表達(dá)基因的cDNA全長，本實驗研究的M14-263基因是其中之一。對M14-263基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示：M14-263基因cDNA與不同物種的Rab類小GTP結(jié)合蛋白基因的核酸序列同源性較高；

3、M14-263基因編碼的蛋白與不同植物中的Rab類小GTP結(jié)合蛋白也都有較高的相似性。作為分子開關(guān)的Rab蛋白家族與植物的生長發(fā)育密切相關(guān)。 本實驗將M14-263基因的cDNA全長片段轉(zhuǎn)入模式植物，研究M14-263基因在分子生物學(xué)方面的表達(dá)模式與轉(zhuǎn)基因植株表型性狀間的關(guān)系以及轉(zhuǎn)基因植株的蛋白的差異表達(dá)情況，進(jìn)而推測．M14-263基因的功能特性。實驗中利用表達(dá)載體pBI121與M14-263基因構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBI-M

4、14-263，并將其導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中。利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，將攜帶有pBI-M14-263的農(nóng)桿菌分別利用葉盤法和花頭浸泡法轉(zhuǎn)入模式植物煙草及擬南芥中，獲得轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)基因組DNA的PCR、Southem 印跡、RT-PCR、Northem印跡等分子生物學(xué)檢測及GUS組織化學(xué)染色檢測后表明，M14-263基因已轉(zhuǎn)入模式植物中，并且在轉(zhuǎn)基因植株的花、莖、葉中均有表達(dá)。 對轉(zhuǎn)M14-263基因植株的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示：

5、M14-263基因的轉(zhuǎn)入導(dǎo)致T0代轉(zhuǎn)M14-263基因煙草植株出現(xiàn)向地性生長現(xiàn)象明顯、分枝增多、頂端優(yōu)勢受到抑制、植株孱弱矮小、花序減少、花在生長過程中易脫落、育性降低等異常的表型變化：而T0代轉(zhuǎn)M14-263基因擬南芥植株則出現(xiàn)孱弱矮小、結(jié)實率降低且死亡一率顯著上升等異常的表型變化。對轉(zhuǎn)M14-263基因煙草植株和未轉(zhuǎn)基因煙草對照植株的葉片進(jìn)行蛋白質(zhì)雙向共發(fā)現(xiàn)顯著差異表達(dá)蛋白點29個，這些差異表達(dá)蛋白包括表達(dá)消失的蛋白點、新表達(dá)的蛋白