Tet-on系統(tǒng)調(diào)控分離酶上調(diào)表達對Hela細胞生物學(xué)性狀影響的初步研究.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文Tet-on系統(tǒng)調(diào)控分離酶上調(diào)表達對Hela細胞生物學(xué)性狀影響的初步研究姓名：付連仲申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：遺傳學(xué)指導(dǎo)教師：劉昕20080501第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文R N A 干擾，減少R a d 2 1r I 瓜N A 的表達后發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞增殖受到抑制，凋亡增加【1 7 】。H u i ‰g 等研究發(fā)現(xiàn)，在過氧化氫誘導(dǎo)下，酵母細胞中類似c a S p a s e s 的s e p a r a S e 通過切

2、割類似R a d 2 1 的M c d l 誘導(dǎo)凋亡【1 8 】。s 印a r a s e 在細胞遺傳物質(zhì)的傳遞、基因組不穩(wěn)定性、腫瘤敏感性及凋亡中的重要作用引起我們極大關(guān)注。但是目前國內(nèi)、外的研究集中在正常真核細胞s 印嬲e 功能方面，而關(guān)于s 印a r a S e 在腫瘤細胞中的作用還沒有文獻報道。既然有研究發(fā)現(xiàn)分離酶低表達或不表達可以增加腫瘤易感性，我們就假設(shè)如果讓本來s 印a r a s e 低表達的腫瘤細胞高表達，那么其生物學(xué)

3、性狀會不會發(fā)生改變呢? 我們選擇H e l a 細胞作為研究的細胞株，主要是其異常染色體均數(shù)多達8 5 條，和正常宮頸上皮細胞染色體4 6 條差別明顯，有利于觀察染色體改變。隨著研究的進展，我們證實了上調(diào)表達的s 印a r a s e 可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的惡性程度，那么這種現(xiàn)象是否和s 印a r a s e 上調(diào)表達腫瘤細胞的凋亡改變有關(guān)呢? 本研究就H e l a 細胞( 腫瘤細胞) 中s 印a r a s e 上調(diào)表達后對

4、生物學(xué)性狀影響做初步的研究。二、方法和結(jié)果1 ．T e t —o n 系統(tǒng)表達調(diào)控模型的建立：質(zhì)粒P S K ．E s p l 用E c o R I ，S a c I I 雙酶切，膠回收目的片段E s p l ，定向克隆插入p T R E ．d 2 E G F P ，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后挑出正確的重組子，采用Ⅺ1 0 I ，S p h I 雙酶切鑒定插入方向，測序鑒定其序列的正確性，成功構(gòu)建E S p l ．p Ⅱ也．d 2 E G F P

5、表達載體。利用F u C m N E6 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染P T c t ．o n 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染2 4 h 后加G 4 1 8 ( 2 0 0 n ∥m 1 ) ，篩選2 周后挑選單個細胞克隆擴大培養(yǎng)。將E s p l - p T R E —d 2 E G F P 質(zhì)粒與P T K ．H y g 質(zhì)粒按摩爾比為2 0 ：1 轉(zhuǎn)染已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染P T e t —o n 質(zhì)粒的H e l a 細胞中，轉(zhuǎn)染2 4 h 后加G 4 1 8 ( 6 0 0

6、斗∥m 1 ) ，潮霉素( 2 0 0 斗∥m 1 ) ，篩選2 周后挑選單個細胞克隆擴大培養(yǎng)。用F Q ．P C R 、W B 分別在m R N A 和蛋白水平上檢測目的基因E s p l 的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)強力霉素( D O x ) 的最適誘導(dǎo)濃度為2 0 0 n ∥m 1 ，E s p l m R N A 從0 ．2 9 3 增加至5 ．1 6 2 ( E S p l ／Q 心D H ) ，蛋白表達轉(zhuǎn)染后明顯增加。2 ．E s

7、p l 上調(diào)表達對H e l a 細胞倍性的影響：收集最適濃度2 0 0 n ∥m lD O X 誘導(dǎo)下的H e l a 細胞，采用秋水仙素法制備染色體，然后人工光學(xué)顯微鏡下計數(shù)染色體，同時利用染色體工作分析站自動分析計數(shù)染色體。采用熒光染色細胞儀分析H e l a 細胞D N A 含量、倍性及細胞周期變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：E s p l 上調(diào)表達后，H e l a 細胞染色體均數(shù)從8 3 條降到7 1 條；H e l a 細胞倍性D I (