糖化酶生產(chǎn)菌的遺傳改良.pdf

1、糖化酶，全稱葡萄糖淀粉酶，又稱淀粉葡萄糖苷酶，功能在于從淀粉、糊精或糖原等碳水化合物的非還原性末端釋放β-D-葡萄糖。糖化酶是水解淀粉產(chǎn)生葡萄糖的主要酶類，因此被廣泛地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、發(fā)酵等工業(yè)，具有很高的商業(yè)價值，是我國產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一。目前，工業(yè)中廣泛使用黑曲霉、泡盛曲霉等為生產(chǎn)菌株來提取糖化酶。 本文首先利用PCR方法從糖化酶工業(yè)生產(chǎn)菌株F0410染色體擴增出包括ITS1、ITS2的部分序列和5.8SrDNA完

2、整序列的保守系列，通過序列測定及比對分析確認(rèn)該菌種為黑曲霉。根據(jù)GenBank上公布的黑曲霉糖化酶基因序列設(shè)計引物，通過PCR擴增得到黑曲霉F0410的糖化酶基因，擴增產(chǎn)物為3327bp，其中糖化酶編碼基因為2167bp，推衍得到的氨基酸序列有640個氨基酸殘基。PCR擴增出的glaA基因片段經(jīng)試劑盒純化后插入到載體pBC-Hygro的SmaI位點，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBC-Hygro-glaA。 構(gòu)建了黑曲霉F0410的PEG-原

3、生質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。用重組質(zhì)粒pBC-Hygro-glaA進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。經(jīng)多次轉(zhuǎn)化在潮霉素B抗性平板上共獲得123株轉(zhuǎn)化子，從中挑選酶活力提高的6株轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵和糖化酶基因拷貝數(shù)的研究。在染色體整合2-3倍的糖化酶基因?qū)μ腔傅倪^量合成是適宜的，糖化酶的活力比出發(fā)菌株提高了12.7％-23％，當(dāng)在染色體整合的糖化酶基因拷貝數(shù)達(dá)到出發(fā)菌株的8倍時，糖化酶的活力僅提高了6％。經(jīng)初篩和復(fù)篩，最終獲得了酶活力顯著提高的轉(zhuǎn)化子GB0506作