糖化酶的固定化

1、19糖化酶的固定化及其在葡萄糖生產(chǎn)中的應(yīng)用工藝糖化酶的固定化及其在葡萄糖生產(chǎn)中的應(yīng)用工藝姓名：吳啟華12生物工程1班學(xué)號(hào)：1214200027指導(dǎo)老師：柯德森、姚焱；同組者：嚴(yán)少杰，李海毅；時(shí)間:2015113020151214摘要：摘要：利用有關(guān)固定化酶的理論和方法，研究固定化糖化酶的效率與糖化酶的濃度的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定固定化糖化酶偶聯(lián)率、相對(duì)活力、活力回收來(lái)衡量其生產(chǎn)工藝的優(yōu)劣，并探討糖化酶的濃度對(duì)固定化效果及結(jié)合牢固程度的影響和

2、驗(yàn)證固定化糖化酶催化生產(chǎn)葡萄糖的重復(fù)使用能力及其效率。制備固定化糖化酶的方法為離子吸附法，并且使用DNS法測(cè)定固定化酶的活力。結(jié)果顯示：在該次實(shí)驗(yàn)中，固定化的效果較好；加入20g離子交換劑固定化酶的活力回收為79.1%，偶聯(lián)率為90.46%，相對(duì)活力為82.58%，加入25g離子交換劑固定化酶的活力回收為85.2%，偶聯(lián)率為92.76%，相對(duì)活力為92.54%。重復(fù)使用葡萄糖固定化酶的過(guò)程中，固定化酶的利用效率降低。酶與載體的濃度比例較

3、高固定化酶葡萄糖生產(chǎn)效率高。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：固定化，糖化酶，葡萄糖，酶活力1、前言：、前言：糖化酶也稱葡萄糖淀粉酶（glucoamylaseEC.3.2.1.3）(淀粉α1，4葡聚糖葡萄糖水解酶)，它能夠催化淀粉液化產(chǎn)物糊精及低聚糖進(jìn)一步水解成葡萄糖。糖化酶對(duì)底物的作用是由非還原端開(kāi)始，將α1，4鍵和α1，6鍵逐一水解，酶作用時(shí)糖苷鍵在C16間斷裂，所產(chǎn)生的葡萄糖為?構(gòu)型，幾乎100%轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?。工業(yè)生產(chǎn)使用的糖化酶主要來(lái)自曲霉、根霉

4、及擬內(nèi)孢霉，它被廣泛應(yīng)用于釀酒、制糖等行業(yè)，是非常重要的酶制劑。酶的固定化方法通常按照用于結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)的類型進(jìn)行分類，大致有三種：非共價(jià)結(jié)合法（結(jié)晶法、分散法、物理吸附法及離子結(jié)合法）；化學(xué)結(jié)合法（包括共價(jià)結(jié)合法及交聯(lián)法）；包埋法（包括微囊法及網(wǎng)絡(luò)法）。本實(shí)驗(yàn)利用離子結(jié)合法制備固定化糖化酶。離子結(jié)合法就是酶通過(guò)離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的不溶性載體的固定化方法，常用的載體有：葡聚糖凝膠、離子交換樹脂、纖維素等。本實(shí)驗(yàn)以離子交換樹脂為載

5、體，應(yīng)用離子交換結(jié)合法制備固定化酶，該法操作簡(jiǎn)便，處理?xiàng)l件溫和，酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞，酶的活性回收率高，可反復(fù)連續(xù)生產(chǎn)，對(duì)稀酶有濃縮作用，載體可再生使用。其缺點(diǎn)是：載體和酶的結(jié)合力弱，容易受緩沖液種類或pH的影響，在高離子強(qiáng)度下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，酶易從載體上脫落。使用共價(jià)結(jié)合法不會(huì)使酶容易脫落，國(guó)外研究者已研究出用氧化鋯涂層多孔玻璃或多孔陶瓷，然后硅烷化，最后用重氮基、醛基和異硫氰基衍生物偶聯(lián)糖化酶，結(jié)果使酶活較高，并

6、且能連續(xù)生產(chǎn)3個(gè)酶半衰期。在此次實(shí)驗(yàn)中還使用用DNS法測(cè)定固定化酶、殘留酶、原酶的活力。2、材料與方法：、材料與方法：2.12.1材料材料：（1）糖化酶液，GF201大孔強(qiáng)堿陰離子交換劑，葡萄糖，可溶性淀粉39酶的固定化：100ml糖化酶液倒入貯液槽中，加入預(yù)處理的離子交換劑20g和25g，不斷輕輕攪拌，開(kāi)始進(jìn)行酶的固定化，30min后過(guò)濾去未固定的酶液，測(cè)量固定化酶及反應(yīng)后殘留酶液活性。2.4.3葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制

7、作取7支干凈的具塞刻度試管（可用封口膠代替），編號(hào)，按表1加入試劑：表1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作管號(hào)試劑1234567葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（mL）00.20.61.01.41.82.0蒸餾水（mL）2.01.81.41.00.60.20葡萄糖含量（mg）00.20.61.01.41.82.035二硝基水楊酸（mL）2.02.02.02.02.02.02.0搖勻，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至20mL。以1號(hào)管作為空白調(diào)零點(diǎn)，在

8、540nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定光密度。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.4.4酶活力的測(cè)定：取酶活力的測(cè)定：取6支干凈的試管，編號(hào)，按表支干凈的試管，編號(hào)，按表2進(jìn)行操作。進(jìn)行操作。表2酶活力測(cè)定取樣表操作項(xiàng)目淀粉酶活力測(cè)定固定化酶活力測(cè)量1%淀粉溶液（mL）1.01.01.01.01.01.0預(yù)保溫將各試管和淀粉溶液置于40℃恒溫水浴中保溫10min淀粉酶原液0.1mL0.1mL0.1mL0.2g0.2g0.2g（1，