第一部分蛋白酶活化受體2(PAR2)活化YAP的分子機制及生物學功能研究第二部分MicroRNA-181b在炎性結腸癌發(fā)展過程中的表達變化.pdf

1、本文從以下幾部分進行了論述：
　　第一部分 蛋白酶活化受體-2(PAR2)活化YAP的分子機制及生物學功能研究
　　腸道慢性炎癥（例如炎性腸病）是一個反復損傷修復的過程，是結腸癌發(fā)生的高危因素之一，炎癌轉化是一個多分子通路參與的復雜過程。蛋白酶活化受體-2是一種介導炎癥反應的G蛋白偶聯(lián)受體，廣泛分布于體內多種組織。IBD的動物模型中PAR2的表達顯著升高，但PAR2是否參與炎癥引起的組織損傷修復及再生還是未知。YAP作為Hi

2、ppo通路的重要下游分子，主要參與組織的更新和穩(wěn)態(tài)的維持。本部分主要研究PAR2活化YAP的分子機制及在DSS誘導腸道組織損傷修復作用。
　　首先，我們在不同細胞株中證實活化PAR2促進YAP的入核及共轉錄活性;敲降PAR2不僅降低YAP蛋白的穩(wěn)定性，而且抑制了TEAD介導的轉錄活性和靶基因的轉錄。Western Blot顯示激活PAR2促進YAP Ser127，Ser397位點的去磷酸化，但是這一過程并不依賴經典的Hippo通路

3、。最近的研究提示，蛋白磷酸酶通過去磷酸化作用參與調節(jié)YAP的磷酸化狀態(tài)。我們研究發(fā)現:利用化學抑制劑(Okadaic acid)及siRNA選擇性地抑制蛋白磷酸酶1(PP1)的活性或者干擾其表達可以阻斷PAR2引起的YAP去磷酸化，同時CoIP實驗顯示:PP1與YAP相互結合，而且PAR2增強兩者的相互結合。除此之外，PAR2活化還促進YAP Y357酪氨酸磷酸化，且SRC家族抑制劑(Dasatinib)阻斷PAR2介導的Y357磷酸化

4、升高。為了確定可能參與此機制的酪氨酸激酶，我們選取受PAR2調控的酪氨酸激酶FYN為目標。敲降FYN顯著減少YAP蛋白表達量，但并不抑制PAR2引起的YAP Y357的磷酸化升高。所以，在我們檢測的結腸癌細胞中，FYN可能通過未知的分子機制調控YAP的穩(wěn)定性。另外，接頭蛋白GAB2也參與了PAR2對YAP的調控，siGAB2不僅可以阻止PAR2介導的YAP Ser127去磷酸化，且可以降低PP1及FYN的穩(wěn)定性。為了驗證PAR2介導YA

5、P活化的具體生物學功能，基于YAP在組織更新中的重要性，我們建立DSS誘導的結腸炎小鼠模型，發(fā)現在DSS損傷后修復階段（DSS后2或4天），PAR2敲降顯著抑制了小鼠結腸隱窩的數目，以及YAP蛋白表達水平和細胞核的定位。這提示:PAR2參與小鼠結腸炎損傷后修復再生過程，而且這一過程可能依賴于YAP的活化。
　　綜上所述，PAR2通過調節(jié)YAP多位點的磷酸化狀態(tài)，促進YAP的核定位、蛋白的穩(wěn)定性以及轉錄活性。在體內，PAR2相關的Y

6、AP活化可能參與炎癥損傷引起的組織修復和再生過程。
　　第二部分 MicroRNA-181b在炎性結腸癌發(fā)展過程中的表達變化
　　miRNAs是一類重要的內源性非編碼小RNA分子，主要通過特異性靶向體內的原癌基因或抑癌基因表達影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本部分主要探討了結腸炎相關結腸癌模型中miRNA-181b的表達變化及其可能的下游靶基因。
　　miRNA-181b的表達在結腸癌中顯著升高，但miRNA-181b是否參與炎癥

7、相關結腸癌的發(fā)生未見報道。聯(lián)合使用氧化偶氮甲烷(AOM)和葡聚糖硫酸鈉(DSS)制備結腸炎相關結腸癌小鼠模型，以實時熒光定量PCR(Real-Time PCR)檢測不同時期小鼠結腸組織miR-181b表達。miR-181b表達在結腸炎相關結腸癌形成過程中逐漸升高，但單獨使用AOM或DSS均不會改變miR-181b水平。利用全基因組表達譜芯片數據結合不同的miRNA靶基因預測軟件初步篩選出miR-181b的下游靶基因Ipmk、E2f5、K