同軸電紡P(3HB-CO-4HB)-(明膠+聚乙烯醇)復合hBMSCs構(gòu)建組織工程骨.pdf

1、目的：
　　采用同軸電紡技術(shù)以3-羥基丁酸-4-羥基丁酸共聚酯(poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate),P(3HB-CO-4HB))為芯，明膠(gelatin,GA)聚、乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)為殼制備骨組織工程支架,將人骨髓間充質(zhì)干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)負載于支架上，體外構(gòu)

2、建細胞-支架復合物，通過體內(nèi)外實驗探討細胞-支架復合物在裸鼠體內(nèi)異位成骨能力。
　　方法:
　　取人髂前上棘骨髓分離培養(yǎng)hBMSCs，傳代培養(yǎng)至第5代，采用流式細胞術(shù)鑒定細胞表面抗原。更換成骨誘導培養(yǎng)基，向成骨細胞方向誘導培養(yǎng)14天，通過堿性磷酸酶(alkaline phosphatase staining,AKP)染色、茜素紅(alizarinred staining,ARS)染色、I型膠原免疫組化染色檢測成骨分化情況。制

3、備8％ w/v的GA+PVA混合水溶液，作為同軸電紡的殼層溶液，以6% w/vP(3HB-CO-4HB)溶液作為芯層溶液，制備同軸電紡支架。采用掃描電鏡和透射電鏡觀察支架材料。同時以6%w/vGA作為殼層溶液，以6%w/vP(3HB-CO-4HB)溶液作為芯層溶液，制備同軸電紡支架后采用掃描電鏡觀察。制備以6% w/vP(3HB-CO-4HB)為芯，以8%w/v的GA+PVA為殼的同軸電紡支架，將人骨髓間充質(zhì)干細胞滴加在支架表面。將細胞

4、-支架復合物體外培養(yǎng)第1天和第7天通過DAPI熒光染色觀察，成骨誘導培養(yǎng)第7天和第14天通過掃描電鏡和DAPI染色觀察細胞在支架上的生長情況。復合物分為實驗組與對照組,實驗組使用成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)、對照組采用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，兩組分別培養(yǎng)14天后植入裸鼠皮下，分別于術(shù)后第8周和16周取出植入物行HE染色，Vonkossa染色，茜素紅染色，I型膠原免疫組化染色評價細胞-支架復合物在體內(nèi)異位成骨的能力。
　　結(jié)果：
　　hBMSC

5、s原代培養(yǎng)隨時間增加，貼壁細胞從圓形變?yōu)槎趟笮?，培養(yǎng)12天后，細胞融合至90%以上，傳代培養(yǎng)至第5代，hBMSCs變?yōu)殚L梭形，排列方向一致，成旋渦狀、平行狀生長。流式細胞術(shù)鑒定高表達CD44、CD73、CD90、CD105細胞表面抗原，不表達CD34、CD45、HLA-DR表面抗原。將完全培養(yǎng)基更換成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)14天后，細胞形態(tài)變?yōu)槎趟笮?、多角形。通過堿性磷酸酶染色、茜素紅染色、I型膠原免疫組化染色顯示均為陽性，未更換成骨誘導液誘

6、導培養(yǎng)的hBMSCs形態(tài)仍為長梭形，相關(guān)骨化學染色為陰性。透射電鏡顯示芯為P(3HB-CO-4HB)，殼為GA+PVA制備的同軸電紡支架具有明顯芯-殼結(jié)構(gòu)，掃描電鏡顯示芯為P(3HB-CO-4HB)，殼為GA制備的支架見電紡成絲性較差，見大量的液滴，液滴表面有纖維伸出，但未能形成連續(xù)完整的纖維形態(tài)，其中部分纖維出現(xiàn)斷裂；而P(3HB-CO-4HB)為芯，GA+PVA為殼制備的支架為三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且相互連通，纖維直徑較為均一。熒光染色見細胞

7、-支架復合物體外培養(yǎng)1天時見細胞較為均勻的分布于支架上，培養(yǎng)第7天時見細胞數(shù)量增多，分布在支架上。成骨誘導培養(yǎng)第7天和第14天時見大量細胞覆蓋于支架材料上。掃描電鏡見復合物成骨誘導培養(yǎng)7天時細胞分布于支架材料表面，誘導培養(yǎng)14天時見細胞覆蓋于支架材料表面，細胞在支架材料上生長良好，分泌大量細胞外基質(zhì)覆蓋于材料表面。將細胞-支架復合物植入裸鼠體內(nèi)，裸鼠生長狀況良好，無全身或局部炎癥及毒性反應，實驗組細胞-支架復合物在第8周、16周時保持原

8、狀，質(zhì)地逐步變硬；對照組細胞-支架復合物植入后8周時體積未見明顯縮小，質(zhì)地較軟；16周時幾乎完全降解。實驗組HE染色、Vonkossa染色、茜素紅染色、I型膠原免疫組織化學染色見骨組織形成，可見骨細胞及骨陷窩形成，鈣鹽沉積、I型膠原隨時間的增加逐漸增多并逐漸成熟。對照組相關(guān)骨化學染色陰性，未見骨細胞、成骨細胞及骨陷窩的形成。
　　結(jié)論：
　　人骨髓間充質(zhì)干細胞復合同軸電紡3-羥基丁酸-4-羥基丁酸共聚酯/(明膠+聚乙烯醇)支