黑曲霉脂肪酶蓋子結構域突變對其活性影響的研究.pdf

1、黑曲霉脂肪酶（Aspergillus niger lipase，ANL）是一類廣泛應用于油脂加工、食品添加劑和洗滌劑添加劑等工業(yè)領域，具有良好生物安全性的生物催化劑。本論文以本課題組保藏的、分離自新疆火山口的脂肪酶高產(chǎn)菌株黑曲霉FJNU01菌株為出發(fā)材料，克隆其脂肪酶基因。通過比較黑曲霉脂肪酶蓋子結構及其兩側鉸鏈區(qū)的氨基酸殘基序列與黑曲霉阿魏酸酯酶（A.niger feruloyl esterase，ANE）對應區(qū)域的氨基酸殘基序列的差

2、異，確定突變位點，構建了一系列脂肪酶突變體。
　　 利用重疊延伸PCR方法，對黑曲霉脂肪酶蓋子結構兩側鉸鏈區(qū)上的氨基酸殘基進行定點突變，獲得了anl-S84G、anl-D99P、anl-K108E三個突變脂肪酶基因；將組成脂肪酶整個α-螺旋蓋子結構的氨基酸殘基序列替換成阿魏酸酯酶對應結構域的氨基酸殘基序列，獲得了脂肪酶突變基因anl-anelid；將組成脂肪酶蓋子結構左右兩側鉸鏈區(qū)的氨基酸殘基序列替換成阿魏酸酯酶對應區(qū)域的氨基酸

3、殘基序列，獲得了脂肪酶突變基因anl-lidLR。
　　 將分子改造后的脂肪酶突變基因插入到pPIC9K質粒中，構建系列重組表達載體；重組表達載體經(jīng)SacⅠ線性化后導入到巴斯德畢赤酵母GS115，篩選得到重組轉化子。重組轉化子經(jīng)甲醇誘導表達，離心收集發(fā)酵上清液，然后用堿性滴定法測定重組脂肪酶突變體酶活。實驗結果表明：GS-pPIC9K-anl-D99P和GS-pPIC9K-anl-K108E重組子發(fā)酵上清液的脂肪酶酶活分別為21

4、.37U/mL和16.30U/mL，相對野生型脂肪酶分別為85.48％和65.20％，而GS-pPIC9K-anl-S84G、GS-pPIC9K-anl-anelid和GS-pPIC9K-anl-lidLR的發(fā)酵上清液均未檢測到脂肪酶活性。用Ni-NTA純化上述發(fā)酵上清液中的重組蛋白，純化后的蛋白質SDS-PAGE電泳結果表明：ANL-S84G、ANL-D99P、ANL-K108E、ANL-anelid均顯示單一條帶，而anl-lidL