多壁碳納米管生物學效應的分子機制研究.pdf

1、近年來，有關納米技術(Nanotechnology)的研究蓬勃發(fā)展。現(xiàn)今，國際上關于納米技術的專業(yè)學術期刊已有近60種，這些刊物的影響因子年年攀升，從中可見本領域研究的熱度。納米技術的發(fā)展高度依賴具有良好性質的納米材料的開發(fā)以及其理化性質的改造。碳納米管是一種由單層或多層石墨片層卷曲而成的空心柱狀碳納米材料，其優(yōu)良的理化性質日益引起人們的關注。研究表明，碳納米管在多個科技領域都具有極大的應用潛力。在生物醫(yī)學領域，近年的研究亦證實，碳納米

2、管是一種優(yōu)良的藥物載體，具有載藥量大、可方便地實現(xiàn)藥物的緩控釋、能實現(xiàn)多功能化等引人入勝的特點;另外，它還是一種具有低背景噪音的成像對比劑及高強度的組織工程基質材料，同時，其獨特的光學、熱學性質還可直接用于殺滅腫瘤細胞。雖然納米粒子對于人類而言早已不陌生（自然界中存在諸多天然的納米粒子），但人類對其生物學性質的了解還相當有限，因此人們對潛在的納米毒副作用予以很大的關注。研究顯示，碳納米管的主要毒副作用包括導致細胞活性氧的產生、誘導炎癥、

3、引起細胞凋亡、誘導正常細胞向癌細胞轉化，以及導致石棉樣毒性等。
　　 碳納米管的應用潛力及毒性的發(fā)生都是在與細胞相互作用的過程中產生的。現(xiàn)在人們已經(jīng)掌握了碳納米管在組織與細胞水平上的部分生物學性質，其中包括經(jīng)由不同途徑（例如口服、靜脈注射、透皮吸收，以及呼吸作用等）進入動物體內后在各器官分布的規(guī)律，納米材料進入細胞的途徑和在亞細胞水平上的定位，以及影響納米材料分布、吸收、代謝以及排泄等過程的理化因素等，但在更進一步的分子層次上的

4、研究則相對比較缺乏。在這方面，研究最多的是碳納米管與蛋白質的相互作用，例如碳納米管表面性質對血清蛋白的吸附規(guī)律。這些分子水平上的研究對了解碳納米管的基本生物學性質具有重要的指導意義，但是，由于大部分研究是在試管內進行的，研究結果無法反映碳納米管與活細胞作用時的真實情況。例如，膜結合蛋白的功能化立體構像需要細胞膜的支撐作用，一旦這些蛋白離開細胞膜，其結構也會發(fā)生改變。因此，研究納米材料在活細胞中與生物分子的相互作用具有實際的生物學意義。<

5、br>　　 本論文的第一部分（第2章）內容是開發(fā)三種用于研究在活細胞內多壁碳納米管（以及其他納米材料）與細胞膜蛋白相互作用的方法。很多細胞膜蛋白參與細胞信號通路的調控，有研究顯示納米材料影響細胞信號通路的傳導。納米材料與細胞接觸后分布于細胞膜上或進入細胞，因此，其影響細胞信號通路的作用靶點可能是細胞膜上的蛋白受體，也可能是細胞內的信號傳導步驟。雖然后一情況已有少量研究報導，納米材料是否會作用于細胞膜上的蛋白受體仍然未知，這在一定程度上

6、是由于缺乏有效的研究方法。這部分研究內容是借鑒生物學中用于研究生物大分子之間相互作用的方法來研究多壁碳納米管與細胞膜受體之間的相互作用。具體方法包括原位的鄰位連接技術(insituPLA)，熒光共振能量轉移技術(FRET)技術以及免疫金電鏡技術。通過構建多壁碳納米管與細胞膜受體相互作用的實驗模型，以及對多壁碳納米管表面進行適當?shù)男揎?，本研究證明上述三種方法可有效地用于研究納米材料與細胞膜受體的相互作用。這些實驗方法將有助于研究納米材料生

7、物學效應的分子機制以及表面修飾對納米材料生物學性質的影響規(guī)律。
　　 本實驗室及其他課題組先前的研究發(fā)現(xiàn)，單壁和多碳納米管能抑制細胞的骨形成蛋白(bonemorphologyproteins，BMP)信號通路。BMP信號通路包括多個信號傳導步驟，我們對碳納米具體的作用機制還不甚明了。在本論文的第2章中，我們利用在第一章中開發(fā)的方法對多壁碳納米管與BMP信號通路相互作用的分子機制進行了探索。研究結果表明，多壁碳納米管與2型BMP受

8、體結合，抑制其磷酸化1型BMP受體的激酶活性是導致BMP信號通路活性下調的原因。這一發(fā)現(xiàn)的意義在于，明確納米材料作用于細胞信號通路的機制之一是通過與細胞膜表面受體相互作用的方式，這種相互作用的本質是納米材料與蛋白的相互作用。這一認識對通過改造多壁碳納米管表面化學來調節(jié)其對細胞命運（例如，干細胞分化）的影響具有理論上的指導作用。
　　 了解碳納米管自身的生物學活性是充分開發(fā)其生物醫(yī)學用途以及避免潛在毒性的前提。在真核細胞內，BMP

9、信號通路參與調節(jié)諸多重要細胞功能。本論文進一步系統(tǒng)地研究了多壁碳納米管對BMP信號通路介導的一系列生物學事件，這些生物學事件包括干細胞的分化、細胞凋亡以及細胞增殖（細胞周期）。
　　 研究碳納米管對干細胞分化功能的影響不僅具有指導組織工程臨床應用的價值，還具有重要的理論意義。這是因為，一方面，研究發(fā)現(xiàn)碳納米管的機械力學以及電學性質十分適合應用于干細胞組織工程中，因此與干細胞相互作用直接影響其作為組織工程基質的生物學表現(xiàn);另一方面

10、，許多調控干細胞分化及命運的信號通路在腫瘤細胞的生理過程中亦發(fā)揮重要的功能，例如，BMP信號通路調節(jié)間充質干細胞的多個分化方向，同時，它也在乳腺癌細胞中具有很高的活性。因此了解碳納米管對干細胞命運的作用規(guī)律對其生物醫(yī)學應用的其他方面亦具有啟發(fā)作用?；谶@一認識，在本論文的第3、4、5章中，我們研究了多壁碳納米管對間充質干細胞系C2C12的成肌分化的影響。研究結果表明，對BMP信號通路的抑制作用增強了C2C12的成肌分化，而且，這種效應受

11、多壁碳納米管表面化學修飾的調節(jié)。對成肌分化過程中分子事件的逐步分析結果顯示，多壁碳納米管抑制BMP信號通路，導致其靶標蛋白——DNA結合抑制蛋白/分化抑制蛋白(Id)的表達水平下調，這減弱了其對成肌調節(jié)因子，一類具有堿性螺旋—環(huán)—螺旋(basichelix-loop-helix，bHLH)結構的蛋白的負調控作用，因此加強成肌分化。由于多壁碳納米管通過抑制2型BMP受體來調節(jié)BMP信號的傳導過程，基于納米材料的表面性質決定其與蛋白相互作用

12、的模式與強度這一認識，我們假設改變多壁碳納米管的表面化學能調節(jié)其與膜蛋白相互作用的模式與強度，從而改變依賴受體功能的信號傳導。用本實驗室先前報導的多壁碳納米管組合化學庫對成肌分化信號的篩選結果證實了這一假設，顯示了對納米材料生物學性質人為調控的可能性。
　　 在本論文的第6、7章中，我們研究了多壁碳納米管抑制BMP信號通路所導致的另一生物學事件。研究結果發(fā)現(xiàn)，多壁碳納米管誘導的p21蛋白的高表達能抑制多種誘因導致的細胞凋亡，并且

13、是導致細胞周期阻滯的原因。p21蛋白既是一種細胞周期素依賴的激酶抑制劑，參與器官發(fā)育過程中及應激條件下細胞周期的調節(jié)，又是一種細胞凋亡的抑制因子。本研究發(fā)現(xiàn)多壁碳納米管對BMP信號通路抑制的另一效應是激活p53非依賴途徑的p21蛋白的高表達。p21蛋白從細胞核內轉移至細胞質中，在線粒體上與凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的前體蛋白Procaspase-3結合，抑制其水解活化成有活性的Caspase-3形式，從而抑制細胞的凋亡過程。另一方面

14、，p21蛋白與CyclinD/CDK4，6復合體結合，抑制該復合體對Retinoblastoma(Rb)蛋白的磷酸化作用，導致對細胞周期的阻滯。
　　 細胞對納米材料的攝入機制是一項重要的研究課題。納米材料的物理因素，包括尺寸及形狀能影響這一過程。在本論文的最后一章中，我們研究了一種具有獨特形狀——二維盤狀的聚合物納米材料(Nanodisks)的細胞攝入規(guī)律及細胞毒性。研究發(fā)現(xiàn)，這種獨特的形狀大大增強了其與細胞膜的相互作用，阻礙