螺旋藻-節(jié)旋藻原生質(zhì)球制備和RAPD分析研究.pdf

1、原生質(zhì)體(球)是生理研究和遺傳育種的良好材料，原生質(zhì)球的制備在節(jié)旋藻基因工程中也是不可缺少的實驗手段。本論文論述了鈍頂節(jié)旋藻FACHB341原生質(zhì)球的制備方法，對已有的制備鈍頂節(jié)旋藻原生質(zhì)球的方法進行了改進。文中探索了節(jié)旋藻原生質(zhì)球制備的最佳去鞘方法、緩沖液最佳pH值、最佳滲透穩(wěn)定劑、最佳的酶組合以及溶菌酶的最佳濃度和酶解時間。實驗結(jié)果證明，制備鈍頂節(jié)旋藻原生質(zhì)球需要將超聲波法、離子法和酶解法相結(jié)合，其有利組合如下：取對數(shù)期的鈍頂節(jié)旋藻

2、FACHB341培養(yǎng)液，置于50mL離心管中進行超聲波處理，能量為：3～5W，超聲處理1.0s，間歇0.5s，處理2min。3000r/min離心10min，收集沉淀，置于含1.0～1.5mol/LNaCl的Zarrouk培養(yǎng)基中洗滌5min。3000r/min離心10min，收集沉淀，用無菌Zarrouk培養(yǎng)基洗滌2～3遍，3000r/min離心10min，收集沉淀。沉淀轉(zhuǎn)入酶解液中。酶液組成為：0.2mol/L磷酸鉀緩沖液pH7.2

3、，滲透穩(wěn)定劑KCl0.8mol/L，0.5％溶菌酶。在28℃～30℃水浴低速震蕩下酶解5～7小時，低滲爆破法檢測原生質(zhì)球，顯微鏡下計數(shù)細胞總數(shù)，經(jīng)伊文思蘭染色液活體染色每隔1.5小時計數(shù)原生質(zhì)球數(shù)目，得出活體原生質(zhì)球得率。此方法可以得到40％以上有活性的鈍頂節(jié)旋藻原生質(zhì)球，為節(jié)旋藻的進一步遺傳轉(zhuǎn)化以及基因工程研究提供了實驗基礎。 同時本研究對本實驗室保存的9株螺旋藻和節(jié)旋藻品系：鈍頂節(jié)旋藻FACHB341、FACHB438、FA

4、CHB439、FACHB793、FACHBJP1、OUQDS6、OUQDS8，極大節(jié)旋藻OUQDSM和螺旋藻FACHB351進行了隨機擴增多態(tài)性DNA研究。為得到一個穩(wěn)定的RAPD反應體系，首先對影響反應體系穩(wěn)定性的主要因子進行了優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果為：在25μL反應體系中DNA模板用量50ng，Mg2+濃度2.5mmol/L，引物濃度為2μmol/L，10mMdNTP1μL，Taq聚合酶1U。反應程序：94℃預變性10min，然后94℃1m

5、in，36℃1min，72℃2min，40個循環(huán)，最后72℃下延伸10min。電泳條帶按照Nei-Li法公式S=2Nxy/(Nx+Ny)獲得各樣品間的相似性，再用D=1-S獲得相應的遺傳距離，應用Phylip軟件包分析，按UPGMA法構(gòu)建聚類分析圖。其結(jié)果如下： (1)對60個隨機引物進行篩選，其中有15個引物重復性好，條帶清晰，多態(tài)性高。15個引物在9個品系總計擴增出140條條帶，平均每個引物擴增出9.3條，其中多態(tài)性條帶為1

6、39條，占99％以上。 (2)通過品系間遺傳距離發(fā)現(xiàn)，各品系間遺傳距離最遠的是FACHB351和OUQDS8，為0.1925，遺傳距離最近的是FACHBJP1和FACHB793，為0.0793，9株藻的遺傳距離從總體上看都相距較近，說明它們的遺傳背景較為相似，這也與它們的分類地位較一致。 (3)從聚類圖上看出，9株品系首先聚為三類，其中FACHB351為第Ⅰ類，F(xiàn)ACHB341為第Ⅱ類，其他7株聚為一類屬第Ⅲ類；第ⅢⅡ類