重組irisin抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　動(dòng)脈粥樣硬化，一種慢性進(jìn)展性的血管病，是引起冠心病、腦梗死、外周血管病的首要原因，在全世界范圍內(nèi)具有很高的發(fā)病率和致死率。它是由多因素共同作用引起的，主要危險(xiǎn)因素有高血壓、高血脂、大量吸煙，還有糖尿病、肥胖和遺傳因素等。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明，其中內(nèi)皮功能紊亂和炎癥起著至關(guān)重要的作用。
　　內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)其細(xì)胞間緊密連接的復(fù)合體，在血液和組織之間形成了一個(gè)選擇性的透過(guò)屏障，所以內(nèi)皮的完整性

2、是維持血管穩(wěn)態(tài)的一個(gè)基本因素。正常內(nèi)皮細(xì)胞可以調(diào)節(jié)血管緊張度及血管結(jié)構(gòu)并且分泌抗凝、抗血小板物質(zhì)和纖溶蛋白，防止細(xì)胞向血管壁粘附聚集，具有抗炎癥反應(yīng)的作用。當(dāng)受到各種有害刺激之后，病灶處的單層內(nèi)皮細(xì)胞被活化而分泌粘附分子，引起白細(xì)胞粘附，進(jìn)而引起血管損害。各種危險(xiǎn)因素可引起血管內(nèi)皮損傷進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。許多研究證實(shí)內(nèi)皮功能失調(diào)不但是始發(fā)因素，而且是動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展中的重要因素，具有足夠存活能力和增殖能力的內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)維持內(nèi)

3、皮完整性和修復(fù)內(nèi)皮損傷至關(guān)重要。所以，維持血管內(nèi)皮完整性、改善和提高內(nèi)皮功能足治療和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵。
　　近年來(lái)骨骼肌已經(jīng)被確定為是一個(gè)內(nèi)分泌器官。由骨骼肌在運(yùn)動(dòng)中或者運(yùn)動(dòng)后隨即分泌的細(xì)胞因子，被稱為肌因子，介導(dǎo)了鍛煉對(duì)代謝和心血管系統(tǒng)產(chǎn)生的一些有益作用。Irisin，一種新發(fā)現(xiàn)的肌因子，是運(yùn)動(dòng)后由骨骼肌產(chǎn)生的。它主要通過(guò)促進(jìn)產(chǎn)熱基因解偶聯(lián)蛋白的表達(dá)促進(jìn)白色脂肪棕色化，從而增加能量消耗、調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)，與肥胖、胰島素抵抗等

4、密切相關(guān)。最近，越來(lái)越多的研究證實(shí)，irisin可以改善肥胖、2型糖尿病、心血管疾病患者的內(nèi)皮功能。但是，irisin在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成中的作用及其機(jī)制，尚未有報(bào)道。
　　研究目的:
　　1.通過(guò)建立小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型，研究irisin對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響。
　　2.通過(guò)體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)研究irisin對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、炎癥、凋亡的影響，并闡明其分子機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.表達(dá)與純化人重組iri

5、sin蛋白。
　　2.建立兩種小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型:單純高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠模型和頸總動(dòng)脈部分結(jié)扎ApoE-/-小鼠模型。
　　單純高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠模型:將16只8周齡的ApoE-/-小鼠，均給予高脂飼料喂養(yǎng)，在喂養(yǎng)的第四周將小鼠隨機(jī)分成兩組，每組8只，分別給予0.5μg/g體重/天irisin和等量生理鹽水腹腔注射。在喂養(yǎng)12周后，取主動(dòng)脈和主動(dòng)脈根部用4％多聚甲醛固定。
　　頸總動(dòng)脈部分

6、結(jié)扎ApoE-/-小鼠模型:將10只8周齡的ApoE-/-小鼠行左側(cè)頸總動(dòng)脈部分結(jié)扎，結(jié)扎后隨機(jī)分成兩組，每組5只，分別給予0.5μg/g體重/天irisin和等量生理鹽水腹腔注射，術(shù)后4周取左側(cè)頸總動(dòng)脈用4％多聚甲醛固定。
　　3.油紅O染色檢測(cè)irisin對(duì)小鼠主動(dòng)脈及主動(dòng)脈根部動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的影響;HE染色檢測(cè)irisin對(duì)小鼠頸總動(dòng)脈新生內(nèi)膜形成的影響。
　　4.CD31、Ki67標(biāo)記的免疫熒光染色檢測(cè)iris

7、in對(duì)血管內(nèi)皮增殖的影響。
　　5.培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)。
　　6.BrdU免疫熒光標(biāo)記法、CCK8法、MTT法檢測(cè)irisin對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。
　　7.microRNA(miRNA)基因芯片分析篩查irisin處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后差異表達(dá)的miRNA。
　　8.細(xì)胞、頸總動(dòng)脈RNA提取及qRT-PCR檢測(cè)相關(guān)microRNA、mRNA的表達(dá)。
　　9.Western blot

8、檢測(cè)irisin處理后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞DLK1、p-ERK、p-eNOS及炎癥、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　10.免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)irisin對(duì)血管炎癥的影響。
　　11.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)irisin對(duì)小鼠血清炎癥因子水平的影響。
　　12.TUNEL熒光標(biāo)記法檢測(cè)irisin對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。
　　13.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)irisin對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。
　　14.用脂質(zhì)

9、體Lipofectamine2000將microRNA126-5p(miR126-5p)的抑制劑和Dlk1的小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染到人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。
　　15.用50μ1含有0.1mg miR126-5p拮抗劑的F-127普郎尼克膠放在小鼠結(jié)扎后的頸總動(dòng)脈的外膜周圍，將miR126-5p拮抗劑轉(zhuǎn)染到頸總動(dòng)脈內(nèi)。
　　16.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:本研究中所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次及3次以上。兩組之間比較采用Student's t檢驗(yàn)，多

10、組之間比較采用單因素方差分析后Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　1.重組irisin可以抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成:
　　(1)高脂飼料喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠腹腔注射irisin8周，油紅O染色結(jié)果顯示:irisin可以抑制主動(dòng)脈和主動(dòng)脈根部粥樣斑塊的形成。
　　(2)左側(cè)頸總動(dòng)脈部分結(jié)扎的小鼠腹腔注射irisin4周，HE染色結(jié)果顯示:ir

11、isin可以抑制頸總動(dòng)脈斑塊的形成。
　　2.Irisin促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖:
　　免疫熒光結(jié)果顯示irisin可以增加頸總動(dòng)脈表達(dá)Ki67的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量。
　　3.Irisin通過(guò)上調(diào)miR126-5p促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖:
　　(1) BrdU免疫熒光標(biāo)記結(jié)果顯示irisin促進(jìn)HUVEC增殖。
　　(2) CCK8實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，20 nM的irisin使HUVEC增殖了約1.

12、26倍。
　　(3)microRNA基因芯片及qRT-PCR結(jié)果顯示irisin可以使HUVEC中miR126-5p的表達(dá)顯著增加。
　　(4) miR126-5p抑制劑抑制irisin誘導(dǎo)的miR126-5p表達(dá)后，BrdU免疫熒光染色和CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR126-5p抑制劑抑制了irisin誘導(dǎo)的HUVEC的增殖。
　　4.Irisin通過(guò)激活ERK信號(hào)通路促進(jìn)miR126-5p表達(dá):
　　(1) W

13、estern blot結(jié)果顯示，irisin可以使人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中磷酸化的ERK蛋白水平升高，ERK通路的抑制劑U0126可以抑制irisin誘導(dǎo)的ERK磷酸化。
　　(2) qRT-PCR結(jié)果顯示ERK通路的抑制劑U0126可以抑制irisin引起的miR126-5p表達(dá)。
　　(3)Western blot結(jié)果顯示miR126-5p抑制劑對(duì)irisin引起的ERK磷酸化無(wú)影響。5.Dlk1是irisin誘導(dǎo)的miR12

14、6-5p的靶基因:
　　(1)qRT-PCR結(jié)果顯示irisin可以使HUVEC中Dlk1的表達(dá)顯著增加，ADAM9、MMP7與SDF-1α表達(dá)未受影響。
　　(2) Western blot結(jié)果顯示，irisin可以使HUVEC中Dlk1蛋白水平下降，miR126-5p抑制劑可以逆轉(zhuǎn)irisin對(duì)Dlk1表達(dá)的抑制作用。
　　(3) CCK8實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示Dlk1的小干擾RNA可以逆轉(zhuǎn)miR126-5p抑制劑對(duì)iri

15、sin誘導(dǎo)的HUVEC增殖的抑制作用。
　　6.抑制miR126-5p表達(dá)減弱了irisin對(duì)頸總動(dòng)脈斑塊形成的抑制作用和對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用:
　　(1) qRT-PCR結(jié)果顯示腹腔注射irisin4周可以使小鼠頸總動(dòng)脈miR126-5p的表達(dá)增加約2.78倍，miR126-5p拮抗劑可以使irisin引起的小鼠頸總動(dòng)脈miR126-5p的表達(dá)降低。
　　(2)左側(cè)頸總動(dòng)脈部分結(jié)扎的小鼠腹腔注射irisin4周，

16、HE染色結(jié)果顯示:miR126-5p拮抗劑可以減弱irisin對(duì)頸總動(dòng)脈斑塊形成的抑制作用。
　　(3)免疫熒光結(jié)果顯示miR126-5p拮抗劑可以抑制irisin引起的頸總動(dòng)脈表達(dá)Ki67內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的增加。
　　7.irisin抑制頸總動(dòng)脈斑塊中炎性細(xì)胞的浸潤(rùn):免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示irisin可以減少頸總動(dòng)脈斑塊中CD68+巨噬細(xì)胞和CD3+T細(xì)胞的面積。
　　8.irisin抑制頸總動(dòng)脈斑塊中炎癥相關(guān)基因的表

17、達(dá):
　　(1) qRT-PCR結(jié)果顯示irisin可以使頸總動(dòng)脈斑塊中IL-6、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1的mRNA水平減少。
　　(2) ELISA結(jié)果顯示irisin可以使ApoE-/-小鼠血清中IL-6、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1的蛋白表達(dá)減少。
　　9.irisin通過(guò)抑制ROS/p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs炎癥反應(yīng):
　　(1)qRT-

18、PCR結(jié)果顯示irisin可以抑制ox-LDL刺激的HUVECs中IL-6、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1的mRNA水平。
　　(2) Western blot結(jié)果顯示irisin抑制了ox-LDL誘導(dǎo)的p38 MAPK磷酸化。
　　(3) Western blot結(jié)果顯示irisin抑制了ox-LDL誘導(dǎo)的NF-κB p65和磷酸化的NF-κB p65表達(dá)，并且使磷酸化的NF-κB p65/NF-κB p65比值降

19、低。
　　(4) Western blot結(jié)果顯示與ox-LDL處理組相比，irisin可以降低細(xì)胞核NF-κBp65的水平，提高細(xì)胞漿NF-κB p65的水平，抑制NF-κB p65的核移位。
　　(5) DCFH-DA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示irisin抑制了ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs內(nèi)ROS表達(dá)。
　　10.irisin抑制頸總動(dòng)脈斑塊中細(xì)胞凋亡:
　　TUNEL熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示irisin可以減少頸總動(dòng)脈斑塊

20、中細(xì)胞凋亡的數(shù)量。
　　11.irisin減少了ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs凋亡:流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，irisin有效減少了ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC凋亡。
　　12.Irisin上調(diào)了Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)了Bax和Caspase-3的表達(dá):Westem blot結(jié)果顯示，irisin可以使Bcl-2的表達(dá)升高，Bax和Caspase-3的表達(dá)下降。
　　結(jié)論:
　　1.重組irisin可以抑制高脂喂養(yǎng)8周

21、的ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈、主動(dòng)脈根部及左側(cè)頸總動(dòng)脈部分結(jié)扎的ApoE-/-小鼠頸總動(dòng)脈中動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。
　　2.體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)irisin能通過(guò)上調(diào)miR126-5p促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。
　　3.Irisin通過(guò)激活ERK信號(hào)通路上調(diào)miR126-5p的表達(dá)，進(jìn)而抑制Dlk的表達(dá)。
　　4.重組irisin可以減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及炎性因子IL-6、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1的