叢枝菌根真菌的分離鑒定和生物學(xué)特性研究及分子探針的設(shè)計(jì)與應(yīng)用.pdf

1、據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國大約有74％的農(nóng)業(yè)耕作土壤不同程度的缺磷，這一事實(shí)限制了農(nóng)業(yè)產(chǎn)量。為了提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量，最有效的措施是使用磷肥。大量施用化學(xué)肥料不僅增加了農(nóng)業(yè)投入，而且會(huì)破壞土壤結(jié)構(gòu)，并造成環(huán)境污染。本論文以叢枝菌根真菌(AMF)為研究對象，探討了分離的AM真菌菌株的生態(tài)分布特點(diǎn)及其生物學(xué)特性，設(shè)計(jì)并應(yīng)用了用于田間檢測的分子探針，建立了嵌套多重PCR快速檢測技術(shù)等。為深入研究或開發(fā)AM真菌生物資源，改善土壤環(huán)境，創(chuàng)建新型的可持續(xù)農(nóng)業(yè)管理模

2、式提供了有用的科學(xué)依據(jù)。 論文在以下幾個(gè)方面開展工作并取得相應(yīng)研究結(jié)果：采用“Trap culture”方法將從我國農(nóng)業(yè)耕作土壤采集的52份土樣進(jìn)行AM真菌繁殖，通過運(yùn)用“Sieving and decanting”方法和單孢分離、培養(yǎng)技術(shù)，獲得了34株AM真菌。其中大多數(shù)為Glomus屬的成員。經(jīng)過無性孢子形態(tài)學(xué)分類和基于PCR現(xiàn)代生物技術(shù)的檢測，15種分離的AM真菌鑒定為我國新記錄種，17種被國際AM真菌菌種保藏中心(IEB

3、)收藏。通過溫室盆栽試驗(yàn)，從獲得的AM真菌中篩選到對玉米生長有明顯促生作用的菌株HAU-01。田間接種試驗(yàn)效果表明，該菌不僅能促進(jìn)玉米苗期生長，提高子苗成活率，而且促使玉米產(chǎn)量增產(chǎn)11.8％，種子淀粉含量提高0.42％。接種AM真菌和混合接種劑明顯改善了宿主植物對土壤重金屬的抗性。模擬Cd污染土壤的接種試驗(yàn)證明，不同AM真菌對重金屬Cd的敏感性有一定差異。高效耐Cd菌根真菌G mosseae能將約80％的Cd累積于根系及菌絲中，減少了C

4、d向宿主植物地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)的速度和濃度，從而緩解了土壤中Cd對植物的毒害作用。這一發(fā)現(xiàn)有可能從一個(gè)側(cè)面解釋菌根植物的抗逆機(jī)制和AMF在鎘污染環(huán)境中的生物修復(fù)作用的應(yīng)用潛力。結(jié)果還表明，隨著土壤Cd水平的提高，琥珀酸脫氫酶(SDH)和堿性磷酸酶(ALP)活性降低，說明這兩種酶對土壤中的Cd含量敏感。 通過對AM真菌核糖體基因25S rDNA的D1-D2高可變區(qū)域的序列分析，設(shè)計(jì)了用于嵌套PCR擴(kuò)增的種特異性引物XLD3-NDL22

5、、XLO3-NDL22、XLA2-LRl等。這些種特異性引物不僅從混雜的DNA樣品中擴(kuò)增到特定的序列，而且從多種AM真菌混合侵染的植物根系中特異性的檢測到相應(yīng)的真菌。分子探針和嵌套PCR技術(shù)的使用，揭示了AM真菌之間，及AM真菌與其它土壤微生物和植物之間的相互關(guān)系，為正確評價(jià)高效菌株的應(yīng)用潛力建立了科學(xué)、實(shí)用的技術(shù)平臺(tái)。另外，本研究中還建立了嵌套多重PCR操作技術(shù)。并首次在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中同時(shí)快速檢測到多種AM真菌。此方法為深入研究

6、AM真菌的分子生態(tài)學(xué)提供了技術(shù)條件。 由于AM真菌尚不能進(jìn)行純培養(yǎng)，難以象其他腐生微生物一樣進(jìn)行分子生物學(xué)操作。本研究從11000個(gè)HAU-B5-B’(G intraradices)孢子中提取總DNA，以λZap Ⅱ?yàn)檩d體，成功構(gòu)建了我國首例AM真菌基因組文庫。并通過Southern雜交，從120個(gè)克隆中篩選到該菌的特異性片段用于設(shè)計(jì)菌株特異性分子探針。文庫的構(gòu)建過程中還證明，在Gigaspora margarita和Glomu