分枝桿菌噬菌體的生物學(xué)特性及基因組學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　結(jié)核病疫情嚴(yán)峻，耐藥率高，新型抗結(jié)核藥物研發(fā)越來越困難，分枝桿菌噬菌體逐漸成為新型抗結(jié)核藥物的研究熱點(diǎn)之一。目前還無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道在國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)新分枝桿菌噬菌體，本研究在國(guó)內(nèi)首次分離鑒定出5株分枝桿菌噬菌體(Mycobacterium Phage)，命名為Chy1、Chy2、Chy3、Chy4和chy5，通過對(duì)其生物學(xué)特性和基因組學(xué)進(jìn)行研究，探尋這5株分枝桿菌噬菌體抗結(jié)核菌的潛力，明確其遺傳背景，為噬菌體的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論

2、基礎(chǔ)和方法指導(dǎo)。
　　方法：
　　1、采用直接分離法和富集法從泥土標(biāo)本中分離、純化分枝桿菌噬菌體。
　　2、比較噬菌體滴度測(cè)定、噬菌體大量擴(kuò)增和收獲的不同方法，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。
　　3、分枝桿菌噬菌體生物學(xué)特性研究
　　3.1、采用PEG8000沉淀法純化分枝桿菌噬菌體，電鏡觀察噬菌體形態(tài)特征。
　　3.2、以不同MOI擴(kuò)增分枝桿菌噬菌體，根據(jù)擴(kuò)增后的產(chǎn)量找出每株噬菌體的最佳MOI。
　　3.3、

3、通過一步生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定分枝桿菌噬菌體潛伏期、裂解期和裂解量。
　　3.4、分離臨床病原菌，用羅氏藥敏培養(yǎng)基進(jìn)行初步菌種鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)，再采用單斑法測(cè)定分枝桿菌噬菌體的宿主譜。
　　3.5、比較分枝桿菌噬菌體在pH值為5.0和7.4的7H9固體培養(yǎng)基中裂解恥垢分枝桿菌mc2155的能力。
　　3.6、比較Chy1、Chy2、Chy3、D294種噬菌體組成雞尾酒制劑與這4種噬菌體分別單獨(dú)裂解恥垢分枝桿菌mc2155的能力，實(shí)

4、驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.7、培養(yǎng)原代巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞吞噬結(jié)核菌后分為3組，1組加入Chy3，2組加入D29，3組為不加噬菌體的空白對(duì)照組，培養(yǎng)過夜后，收集細(xì)胞，電鏡觀察噬菌體對(duì)巨噬細(xì)胞胞內(nèi)結(jié)核菌的影響。
　　4、分枝桿菌噬菌體全基因組測(cè)序
　　4.1、用λ噬菌體DNA提取試劑盒提取分枝桿菌噬菌體基因組DNA，限制性內(nèi)切酶酶切后進(jìn)行瓊

5、脂糖凝膠電泳，觀察電泳結(jié)果。
　　4.2、基于鳥槍法隨機(jī)測(cè)序和重疊群組裝的方法進(jìn)行測(cè)序：構(gòu)建文庫(kù)，隨機(jī)挑取克隆片段測(cè)序，拼接成大小不一的重疊群，最后通過PCR法填補(bǔ)各重疊群之間的缺口，得到完整的全基因組序列。
　　4.3、組裝成環(huán)形的噬菌體采用DNAStar程序包中的GeneQuest軟件對(duì)其基因組列進(jìn)行電子酶切分析，并與實(shí)際酶切圖譜進(jìn)行比較，以確定噬菌體基因組是否為環(huán)形。
　　5、分枝桿菌噬菌體基因組生物信息學(xué)分析<

6、br>　　5.1、分枝桿菌噬菌體基因預(yù)測(cè)及基因組注釋
　　(1)分析5株分枝桿菌噬菌體基因組的一般特性：
　?、俨捎肈NAStar軟件包中Editseq軟件分析基因組大小，堿基組成，基因平均長(zhǎng)度、基因密度以及5株噬菌體遺傳密碼子的使用頻率及其偏嗜性。
　?、诓捎肨RF軟件預(yù)測(cè)基因組中的串聯(lián)重復(fù)序列。
　　③通過tRNAscan軟件預(yù)測(cè)基因組中的tRNA區(qū)域。
　　(2)采用Glimmer3.0和GeneMa

7、rk基因預(yù)測(cè)軟件對(duì)基因組進(jìn)行基因de novo預(yù)測(cè)，推定5株分枝桿菌噬菌體基因組編碼序列。
　　(3)用Blast和Clustal軟件將推定基因與nr，swissport，tremble，cog數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行同源比對(duì)，E value為1e-5，對(duì)每個(gè)預(yù)測(cè)出來的基因選取同源比對(duì)上分值最高的序列，預(yù)測(cè)基因功能。
　　6、分枝桿菌噬菌體比較基因組學(xué)
　　6.1、將5個(gè)分枝桿菌噬菌體的基因與公共數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)進(jìn)行Blast m

8、8比對(duì)，e-value<=1e-5，選取每個(gè)蛋白的最好比對(duì)結(jié)果，將兩兩比對(duì)均是最好的結(jié)果保留，繪制共線性圖。
　　6.2、先將所有的基因序列用Clustal W軟件進(jìn)行兩兩比對(duì)，計(jì)算得到包含每對(duì)序列分歧程度的距離矩陣，再根據(jù)距離矩陣計(jì)算得到引導(dǎo)樹，最后根據(jù)前面得到的引導(dǎo)樹分支順序，逐級(jí)比對(duì)，得到全部序列的全局比對(duì)結(jié)果，用tree view軟件生成進(jìn)化樹。
　　結(jié)果：
　　1、采用富集法分離純化得到5株分枝桿菌噬菌體，根

9、據(jù)分離地點(diǎn)分別命名為Chy1、Chy2、Chy3、Chy4和Chy5。這5株噬菌體的噬菌斑均為圓形、透明、清晰，呈裂解性噬菌體噬菌斑特點(diǎn)，但Chy2、Chy4和Chy5培養(yǎng)超過48h后噬菌斑逐漸變混濁。
　　2、優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采取小平板法測(cè)定噬菌體滴度，雙層固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法大量擴(kuò)增噬菌體以及刮取上層培養(yǎng)基離心的方法收集噬菌體。
　　3、分枝桿菌噬菌體生物學(xué)特性研究
　　3.1、Chy1、Chy3、Chy4

10、和Chy5噬菌體頭部均為多面立體對(duì)稱，而Chy2噬菌體頭部呈橢圓形。5株噬菌體均具有長(zhǎng)尾，可彎曲，但不可收縮，可見尾板和尾絲，依據(jù)ICTV第八次報(bào)告的最新病毒分類系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)屬長(zhǎng)尾噬菌體科(Siphoviridae)。
　　3.2、Chy1最佳MOI為1.4×10-6，Chy2最佳MOI為9.58×10-5，Chy3最佳MOI為1.1×10-4，Chy4最佳MOI為4.5×10-5，Chy5最佳MOI為1.8×10-5，后續(xù)實(shí)驗(yàn)大量

11、擴(kuò)增這些噬菌體時(shí)，均根據(jù)最佳MOI擴(kuò)增，以達(dá)到最大產(chǎn)量。
　　3.3、Chy2感染恥垢分枝桿菌mc2155的潛伏時(shí)間約為210min，裂解期為60min，270min后進(jìn)入平臺(tái)期，噬菌體滴度不再增加，裂解量為23；Chy3感染恥垢分枝桿菌mc2155的潛伏時(shí)間約為150min，裂解期為90min，240min后進(jìn)入平臺(tái)期，噬菌體滴度不再增加，裂解量為40；Chy1、Chy4和Chy5潛伏期超過420min。
　　3.4、共收

12、集臨床病原菌36株，經(jīng)菌種鑒定，有32株為結(jié)核分枝桿菌(結(jié)核菌)，2株為牛結(jié)核分枝桿菌，2株為非結(jié)核分枝桿菌。這5株分枝桿菌噬菌體的宿主譜較廣，能裂解MS mc2155、結(jié)核菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv、大部分臨床分離耐藥結(jié)核菌株、耐藥牛結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，其中Chy1對(duì)廣泛耐藥結(jié)核菌裂解率達(dá)100％。
　　3.5、抗菌能力最強(qiáng)的噬菌體是D29(P<0.05)，48h內(nèi)幾乎裂解所有的恥垢分枝桿菌mc2155，48h后細(xì)菌數(shù)量逐漸回

13、升，但仍比初始加入的細(xì)菌數(shù)少，維持在較低水平，其次是雞尾酒制劑，24h內(nèi)能裂解大多數(shù)恥垢分枝桿菌mc2155，但24h后細(xì)菌數(shù)逐漸增多，到96h時(shí)細(xì)菌數(shù)與Chy2和Chy3組己無(wú)差別(P>0.05)。Chy1、Chy2和Chy33個(gè)新分離的噬菌體中，Chy3早期(48h)殺菌能力最強(qiáng)(P<0.05)，但到96h時(shí)細(xì)菌數(shù)與Chy2相當(dāng)(P>0.05)，Chy1殺菌能力最弱，在48h內(nèi)不能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，但48h后MS不再增加，維持在109C

14、FU左右，細(xì)菌數(shù)比空白對(duì)照組少(P<0.05)。
　　3.6、當(dāng)7H9固體培養(yǎng)基pH值為5.0和7.4時(shí)，Chy1、Chy2和Chy3均能裂解恥垢分枝桿菌mc2155。
　　3.7、電鏡觀察發(fā)現(xiàn)Chy3組和D29組結(jié)核菌數(shù)量少，菌體結(jié)構(gòu)明顯被破壞，而空白對(duì)照組結(jié)核菌數(shù)量較多，細(xì)菌結(jié)構(gòu)仍完整。
　　4、分枝桿菌噬菌體全基因組測(cè)序
　　4.1、5株噬菌體基因組DNA均可被。EcoR I、HindⅢ和BamHⅠ切開，這

15、3種核酸內(nèi)切酶均能識(shí)別并切割雙鏈DNA分子特定的核苷酸序列，表明這5株噬菌體基因組均為雙鏈DNA。分析酶切圖譜發(fā)現(xiàn)這5株噬菌體基因組大小均在40-50 kb之間。
　　4.2、5株噬菌體測(cè)序質(zhì)量達(dá)到完成圖標(biāo)準(zhǔn)。Chy1、Chy2、Chy4和Chy5最終均組裝為線狀重疊群。雖然Chy3組裝為環(huán)狀重疊群，但實(shí)際酶切圖譜中，HindⅢ將Chy3基因組切為2個(gè)條帶，與線性電子酶切圖譜相同，所以Chy3基因組很可能是線性。
　　5、分

16、枝桿菌噬菌體基因預(yù)測(cè)及基因組注釋
　　5.1、Chy1
　　(1)Chy1基因組全長(zhǎng)為47198 bp，G+C含量為63.68％，基因平均長(zhǎng)度為562 bp，基因密度為0.92。Chy1有明顯的遺傳密碼子偏嗜性，未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)序列，共預(yù)測(cè)出5個(gè)tRNA。
　　(2)采用glimmer軟件分析，確定了77個(gè)推定基因(GL)，對(duì)這些基因進(jìn)行同源檢索分析，得到29個(gè)己知功能的基因。GL05、GL10、GL12、GL13、GL

17、20、GL23、GL24和GL25為噬菌體的結(jié)構(gòu)基因；GL06、GL07和GL08分別編碼LysA、holin和LysB；GL31為整合酶基因，GL70推定為阻遏蛋白類似基因，與D29p72基因序列100％相似，D29p72在進(jìn)化過程中丟失了N-末端的一個(gè)片段，缺乏完整的HTH模體，不能結(jié)合到宿主菌DNA上，因而不能形成溶原性反應(yīng)，即Chy1為裂解性噬菌體。GeneMark軟件分析，共預(yù)測(cè)出71個(gè)推定基因(GM)，其中有55個(gè)基因與gl

18、immer軟件分析結(jié)果相同，有16個(gè)不同的基因，通過比對(duì)，發(fā)現(xiàn)GM22與GL23，GM08與GL09，GM51與GL55，GM52與GL56具有相同功能，其余基因未能匹配上已知功能的基因。
　　5.2、Chy2
　　(1)Chy2基因組全長(zhǎng)為40017 bp，G+C-66.73％，基因平均長(zhǎng)度為656 bp，基因密度為0.951。Chy2有明顯的遺傳密碼子偏嗜性，共發(fā)現(xiàn)3個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列，未發(fā)現(xiàn)tRNA。
　　(2)采用

19、glimmer在線分析軟件分析，確定了58個(gè)推定基因，對(duì)這些基因進(jìn)行同源檢索分析，得到16個(gè)已知功能的基因。GL02、GL05、GL06、GL12、GL13、GL15、GL17和GL19為噬菌體的結(jié)構(gòu)基因；GL26、GL27分別編碼LysA和LysB，未發(fā)現(xiàn)holin基因；GL31為整合酶基因，GL32推定為阻遏蛋白基因，與分枝桿菌噬菌體Halo的gp33基因序列100％相似，Halo是溶原性噬菌體，gp33表達(dá)的產(chǎn)物是阻遏蛋白，即Ch

20、y2為溶原性噬菌體。GeneMark軟件分析，共預(yù)測(cè)出54個(gè)推定基因，其中有44個(gè)基因與glimmer軟件分析結(jié)果相同，有10個(gè)不同的基因，通過比對(duì)，發(fā)現(xiàn)GM15與GL12具有相同功能，其余基因未能匹配上己知功能的基因。
　　5.3、Chy3
　　(1)Chy3基因組全長(zhǎng)為40070 bp，G+C=66.86％，基因平均長(zhǎng)度為667 bp，基因密度為0.97。Chy3有明顯的遺傳密碼子偏嗜性，共發(fā)現(xiàn)3個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列，未發(fā)現(xiàn)t

21、RNA。
　　(2)采用glimmer在線分析軟件分析，確定了58個(gè)推定基因，對(duì)這些基因進(jìn)行逐個(gè)同源檢索分析，得到20個(gè)已知功能的基因。GL01、GL41、GL43、GL45、GL47、GL48、GL54、GL55和GL58為噬菌體的結(jié)構(gòu)基因，位于整合酶基因(GL29)的兩側(cè)；GL33、GL34分別編碼LysB和LysA，未發(fā)現(xiàn)holin基因和編碼阻遏蛋白的基因，即Chy3為裂解性噬菌體。GeneMark軟件分析，共預(yù)測(cè)出56個(gè)推

22、定基因，其中有46個(gè)基因與glimmer軟件分析結(jié)果相同，有10個(gè)不同的基因，通過比對(duì)，發(fā)現(xiàn)GM43與GL43具有相同功能，其余基因未能匹配上已知功能的基因。
　　5.4、Chy4
　　(1)Chy4基因組全長(zhǎng)為46639 bp，G+C=63.68％，基因平均長(zhǎng)度為586 bp，基因密度為0.92。Chy4有明顯的遺傳密碼子偏嗜性，未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)序列，共發(fā)現(xiàn)5個(gè)tRNA。
　　(2)采用glimmer在線分析軟件分析，

23、確定了73個(gè)推定基因，對(duì)這些基因進(jìn)行同源檢索分析，得到28個(gè)已知功能的基因。GL05、GL10、GL12、GL13、GL20、GL23、GL24和GL25為噬菌體的結(jié)構(gòu)基因；GL06、GL07和GL08分別編碼LysA、holin和LysB；GL31為整合酶基因，GL71與編碼噬菌體L5阻遏蛋白的gp71相似性為86.3％，L5 gp71具有183 aa，而Chy4 GL71僅含155個(gè)aa，是否能編碼有活性的阻遏蛋白還未知，即Chy4

24、很可能為溶原性噬菌體。GeneMark軟件分析，共預(yù)測(cè)出70個(gè)推定基因，其中有55個(gè)基因與glimmer軟件分析結(jié)果相同，有15個(gè)不同的基因，通過比對(duì)，發(fā)現(xiàn)GM09與GL09，GM23與GL23，GM46與GL47，GM54與GL57具有相同功能，其余基因未能匹配上已知功能的基因。
　　5.5、Chy5
　　(1)Chy5基因組全長(zhǎng)為51214 bp，G+C=66.74％，基因平均長(zhǎng)度為530bp，基因密度為0.91。Chy

25、5有明顯的遺傳密碼子偏嗜性，未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)序列，共發(fā)現(xiàn)5個(gè)tRNA。
　　(2)采用glimmer在線分析軟件分析，確定了88個(gè)推定基因，對(duì)這些基因進(jìn)行逐個(gè)同源檢索分析，得到29個(gè)已知功能的基因。GL05、GL10、GL12、GL13、GL20、GL23、GL24和GL25為噬菌體的結(jié)構(gòu)基因；GL06、GL07、GL08分別編碼LysA、holin和LysB；GL31為整合酶基因，gene70與分枝桿菌噬菌體Pukovnik編碼阻

26、遏蛋白的基因gp72相似性為70.81％，推定為編碼阻遏蛋白的基因，是否能編碼有活性的阻遏蛋白還未知，即Chy5很可能為溶原性噬菌體。GeneMark軟件分析，共預(yù)測(cè)出86個(gè)基因，其中有68個(gè)基因與Glimmer3.0軟件分析結(jié)果相同，有18個(gè)不同的基因，通過比對(duì)，發(fā)現(xiàn)GM09與GL09，GM12與GL12，GM23與GL23，GM55與GL54，GM63與GL62具有相同功能，其余基因未能匹配上已知功能的基因。
　　6、分枝桿菌

27、噬菌體比較基因組學(xué)
　　6.1、共線性分析
　　(1)Chy1同源性最高的兩株噬菌體為D29和Che12，可歸入ClusterA，同源性基因分布在整個(gè)基因組，具有清晰的共線性。Chy1基因組77個(gè)基因中有75個(gè)基因與D29的基因具有同源性，有60個(gè)基因與Che12的基因具有同源性。
　　(2)Chy2同源性最高的兩株噬菌體為BPs和Angel，可歸入ClusterG，同源性基因分布在整個(gè)基因組，具有清晰的共線性。Chy

28、2基因組58個(gè)基因中有57個(gè)基因均與這兩個(gè)噬菌體具有同源性。
　　(3)Chy3同源性最高的兩株噬菌體為BPs和Angel，可歸入ClusterG，同源性基因分布在整個(gè)基因組，Chy3基因組58個(gè)基因組中有56個(gè)基因均與這兩個(gè)噬菌體具有同源性。Chy3基因組前3個(gè)基因與BPs和Angel前3個(gè)基因匹配，但從第4個(gè)基因開始與BPs和Angel的同源基因排列順序相反。
　　(4)Chy4同源性最高的兩株噬菌體為D29和Che12

29、，可歸入ClusterA，同源性基因分布在整個(gè)基因組，具有清晰的共線性。Chy4基因組73個(gè)基因組中有70個(gè)基因與D29具有同源性，有54個(gè)基因與Che12具有同源性。
　　(5)Chy5同源性最高的兩株噬菌體為D29和Pukovnik，可歸入Cluster A，同源性基因分布在整個(gè)基因組，具有清晰的共線性。Chy5基因組88個(gè)基因組中有70個(gè)基因與D29具有同源性，有57個(gè)基因與Pukovnik具有同源性。
　　6.2、進(jìn)

30、化樹分析
　　對(duì)14株分枝桿菌噬菌體基因組進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析構(gòu)建進(jìn)化樹，距離越近，噬菌體間親緣關(guān)系越近。Chy1與D29親緣關(guān)系最近，Chy4與Chy5親緣關(guān)系最近，Chy2與BPs、Angel親緣關(guān)系最近，Chy3與Legendre親緣關(guān)系最近。
　　結(jié)論：
　　5株分枝桿菌噬菌體均屬于雙鏈DNA病毒群(群Ⅰ)，尾病毒目，長(zhǎng)尾病毒科。Chy1和Chy3為裂解性噬菌體，Chy2為溶原性噬菌體，Chy4和Chy5為可疑溶原