莧菜甜菜紅素合成的生理生化與分子生物學研究.pdf

1、甜菜紅素是一種吲哚來源的天然植物色素，具有抗氧化、抗癌等生理功能，廣泛存在于不含花青素的部分石竹目部分植物中。莧菜富含甜菜紅素，有取代甜菜作為甜菜紅素主要來源的趨勢。盡管參與甜菜紅素合成途徑中一些關鍵基因和多數(shù)關鍵酶已經(jīng)在甜菜等作物中被發(fā)現(xiàn)，但甜菜色素合成機制仍未被完全揭示，而且莧菜中參與甜菜紅素合成的關鍵基因和關鍵酶也大多未見報道。因此，研究莧菜甜菜紅素合成機制可以進一步完善甜菜紅素代謝通路，也為更好利用莧菜資源提供理論依據(jù)。

2、　　本文以葉用莧菜為材料，進行了甜菜紅素合成途徑關鍵基因的克隆，克隆到3條糖基轉移酶基因、1條AmaTyDC基因和1條AmaDODA基因的cDNA序列和gDNA序列，并克隆了AmaB5-GT和AmaDOPA5-GT基因的啟動子序列。研究了這些基因在莧菜不同品種間、不同組織部位及在植物生長調節(jié)劑和不同光質處理后的表達情況，并進一步分析了這些基因的表達與莧菜中甜菜紅素含量的關系。以紅莧品種‘大紅’莧菜為材料，對葉片的紅色部分和綠色部分進行轉

3、錄組測序，揭示影響甜菜紅素合成的相關代謝網(wǎng)絡及可能的影響因素，結合紅色葉片和綠色葉片的生理生化指標系統(tǒng)地分析了莧菜葉片紅綠部分呈色的分子機理。
　　1、莧菜甜菜紅素合成相關基因及啟動子克隆與分析
　　利用 RT-PCR和 RACE技術成功從‘大紅’莧菜中克隆了3條糖基轉移酶基因：AmaDOPA5-GT（GenBank登錄號為：kp174811，長度為1,700 bp）、AmaB6-GT（GenBank登錄號為：kp17481

4、2，長度為1,674 bp）、AmaB5-GT（GenBank登錄號為：kp174810，長度為1,666 bp），1條多巴脫羧酶基因AmaTyDC（GenBank登錄號為：Kp165397，長度為1,669 bp）和1條雙加氧酶基因AmaDODA（GenBank登錄號為：kp165399，長度為1,085 bp） cDNA序列。并獲得了這5條基因的gDNA序列，其中只有AmaDODA具有2個內含子，其它4條不具有內含子。
　　并

5、進一步對 AmaDOPA5-GT和 AmaB5-GT基因的啟動子序列進行了克隆，通過對其順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，它們均含有豐富的響應光、激素、厭氧、干旱及其它脅迫順式作用元件以及 MYB轉錄因子結合位點，推測這兩個基因的表達可能受光、激素、逆境脅迫以及MYB轉錄因子的調控。
　　2、莧菜甜菜色素含量與合成相關基因表達水平的關聯(lián)分析
　　2.1、不同莧菜品種、不同組織部位中甜菜紅素含量和合成相關基因的表達情況研究
　　不同

6、莧菜品種中甜菜紅素含量差異較大，全紅莧菜甜菜紅素含量最高，綠莧中含量較少。實時定量PCR結果表明，AmaB6-GT、AmaB5-GT、AmaDOPA5-GT和AmaTyDC四條基因均在紅莧菜中表達量最高，AmaTyDC和AmaB6-GT在各莧菜品種中的表達量與它們含有的甜菜紅素趨勢一致，推測它們直接參與甜菜紅素合成的調控；AmaDODA基因在四個莧菜品種中的表達量差異不大，這可能與其參與其它代謝有關。進一步對AmaB5-GT、AmaB6

7、-GT、AmaDOPA5-GT在‘大紅’莧菜各組織器官中的表達分析，結果表明它們分別在葉柄、葉、根和綠葉部分表達量最高，這與甜菜紅素含量：紅色葉片>綠色葉片>紅莖>根>綠莖和葉柄含量的差異趨勢不一致。
　　2.2、不同激素處理對莧菜甜菜紅素累積與相關基因表達量的影響
　　細胞分裂素（KT和6-BA）處理可提高莧菜幼苗中甜菜紅素含量。其中KT通過誘導糖基轉移酶基因的表達而提高莧菜幼苗中甜菜紅素的含量；而6-BA促進 AmaDO

8、DA和AmaB5-GT的表達，6-BA通過提高多巴雙加氧酶的活性，增加了 AmaDOPA5-GT和AmaB5-GT可以催化生成莧菜苷的底物，從而促進了莧菜中甜菜紅素的累積。而外源GA3和2,4-D抑制色素的累積。2,4-D處理的幼苗中，AmaB5-GT、AmaTyDC和AmaB6-GT的表達量與色素含量一致的降低。GA3具有轉移甜菜紅素合成前體物的作用，所以其它相關合成的基因表達水平高并不能使莧菜中累積較多的甜菜紅素。
　　2.3

9、、不同光質處理對莧菜甜菜紅素累積與相關基因表達量的影響
　　對不同光質處理條件下莧菜幼苗中甜菜紅素含量的變化的研究表明短波長光質（藍光）有利于色素的累積，這與莧菜幼苗中AmaTyDC、AmaB5-GT和AmaDOPA5-GT三個基因的表達量一致，說明這3個基因表達對甜菜紅素的合成影響較大。然而這3個基因與AmaDODA在紅光照射下表達量也較高，可能與莧菜幼苗中莧菜苷含量減少引起的反饋調節(jié)有關。
　　3、甜菜紅素分布及甜菜紅素

10、含量不同的莧菜品種、組織部位生理生化指標差異研究
　　3.1、甜菜紅素分布和淀粉含量研究
　　徒手切片法對甜菜紅素在‘大紅’莧菜和‘白圓葉’莧菜不同組織部位的分布情況的研究表明：甜菜紅素在‘大紅’莧菜中主要分布在葉片背面靠近葉脈的表皮細胞及各組織部位的維管束周圍的鞘細胞中，在‘白圓葉’莧菜的各組織部位觀察不到甜菜紅素的存在。另外，在‘白圓葉’莧菜的葉片中淀粉粒數(shù)量明顯多于‘大紅’莧菜，同時在‘大紅’莧菜中僅在靠近葉脈部位發(fā)現(xiàn)

11、較多的淀粉粒。
　　3.2、紅葉和綠葉部分光合速率、抗氧化能力、葉綠素熒光差異研究
　　分別測定了‘大紅’莧菜紅葉部分和綠葉部分的光合速率。發(fā)現(xiàn)‘大紅’莧菜葉片紅色部分凈光合速率明顯低于綠色部分。
　　研究了‘大紅’莧菜紅葉和綠葉部分抗氧化能力差異，發(fā)現(xiàn)‘大紅’莧菜紅色部分比綠色部分具有更高的SOD酶活性和總抗氧化能力。說明了甜菜紅素具有清除植物體內羥自由基和活性氧的能力。
　　研究了室溫條件（25℃）和高溫處理

12、（40℃）下，‘大紅’莧菜紅葉和綠葉部分葉綠素熒光差異情況，發(fā)現(xiàn)在室溫條件（25℃）下，綠葉部分光合能力明顯高于紅葉部分，而在高溫（40℃）處理后，莧菜葉片紅色部分光合能力的降低水平明顯低于綠葉部分，說明甜菜紅素對莧菜具抗熱脅迫作用。
　　4、莧菜葉片紅色部分和綠色部分轉錄組差異分析
　　利用RNA-Seq技術比較分析了‘大紅’莧菜葉片紅色部分和綠色部分轉錄組差異，獲得80,026條莧菜Unigene，其中2,178條uni

13、gene（1,320條上調，858條下調）在紅綠葉樣品間表達差異顯著。對這些差異表達基因進行功能歸類分析發(fā)現(xiàn)：這些基因主要涉及次級代謝、植物激素信號傳導、光合作用、淀粉和糖代謝等途徑。這些基因的差異表達在一定程度上驗證了我們在前期獲得的結果。本研究還發(fā)現(xiàn)類黃酮代謝相關基因在紅色葉片中下調顯著，這印證了甜菜紅素合成和類黃酮在植物中的競爭關系，也可以在一定程度上解釋甜菜紅素和花青素“不共存”現(xiàn)象。另外，一些MYB轉錄因子家族基因在紅綠葉部分