釀酒酵母乙醇脫氫酶2和乙醛脫氫酶以及兩種水生動(dòng)物抗菌肽的表達(dá)和酶活分析.pdf

1、1乙醇脫氫酶2和乙醛脫氫酶的表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析
　　 釀酒酵母中的乙醇脫氫酶2催化乙醇氧化生成乙醛,乙醛脫氫酶催化乙醛氧化生成乙酸。本研究從釀酒酵母基因組中分別克隆、表達(dá)乙醇脫氫酶2和乙醛脫氫酶,對(duì)其進(jìn)行了純化,然后體外測(cè)定酶活及酶動(dòng)力學(xué)分析。為研發(fā)新型解酒食品提供理論基礎(chǔ)。主要內(nèi)容如下:
　　 1.1從釀酒酵母基因組DNA擴(kuò)增獲得6種酶的基因并構(gòu)建了6個(gè)表達(dá)載體,pRX2-ADH2、pRX2-ALDH6、pRX2-AL

2、DH2、pRX2-ALDH3、pRX2-ALDH4和pRX2-ALDH5,分別轉(zhuǎn)化E.coli BL21,通過(guò)乳糖自誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白,6種酶得到成功表達(dá),但ADH2和ALDH4主要以包涵體形式表達(dá)；
　　 1.2重新構(gòu)建3個(gè)表達(dá)載體,pGEX-ADH2,pBAD-ADH2和pBAD-ALDH4,優(yōu)化表達(dá)條件,初步判斷ALDH4以可溶性形式表達(dá),ADH2仍然以包涵體形式表達(dá)；
　　 1.3采用Ni-NTA His.Bind

3、 Resin親和層析柱純化帶有6His·Tag的重組蛋白,純化后經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的純度約為90％；采用Bradford蛋白測(cè)定法測(cè)得ADH2、ALDH6、ALDH2、ALDH3和ALDH5濃度分別為2.07mg／mL,1.624mg／mL,0.6635 mg／mL,0.7596 mg／mL和0.9615 mg／mL；
　　 1.4體外測(cè)定復(fù)性后的ADH2和純化得到的乙醛脫氫酶活性,通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定產(chǎn)物β-

4、NADH和β-NADPH的生成量,結(jié)果顯示ADH2、ALDH6、ALDH2、ALDH3和ALDH5的比活力分別約為2.107U／mg,16.86U／mg,1.416U／mg,1.566U／mg和2.742U／mg;
　　 1.5研究溫度、pH值和金屬離子對(duì)ADH2和乙醛脫氫酶活力的影響。得出ADH2、ALDH6、ALDH5、ALDH2和ALDH3最適溫度分別為45℃,30℃,37℃,37℃和50℃,最適pH值分別為7.4,7.4

5、,8.0,7.4和8.5。
　　 1.6研究ADH2和乙醛脫氫酶酶動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。ADH2對(duì)NAD+和乙醇的Km分別為1.1mM和120μM,ALDH6和ALDH5對(duì)NADP+和乙醛的Km分別為(101μM,42μM)和(664μM,129μM),ALDH2和ALDH3對(duì)NAD+和氨基丙醛的Km分別為(471μM,17.5μM)和(410μM,8.6μM)。
　　 2兩種抗菌肽的克隆、表達(dá)及活性分析
　　 將兩種水生

6、動(dòng)物分泌的抗菌肽基因克隆到原核表達(dá)載體pGEX-4T-1上,構(gòu)建了pGEX-Y18和pGEX-CEC1兩個(gè)融合蛋白表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌Escherichia coli Rosetta中進(jìn)行表達(dá),表達(dá)的融合蛋白主要以包涵體形式存在。融合蛋白經(jīng)復(fù)性、酶切處理獲得抗菌Y18和CEC1。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,融合蛋白GST-Y18和GST-CEC1、抗菌肽Y18和CEC1都能有效地抑制E.coli DH5α、Bacillus subtilis