用亞硫酸鈉制造新的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞化學(xué)缺氧模型的評(píng)價(jià).pdf

1、目的:探索將亞硫酸鈉用于建立體外培養(yǎng)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞缺氧模型的可行性。
　　方法:1.酶消化法取雄性SD大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)進(jìn)行原代培養(yǎng)。
　　2.采用小鼠抗大鼠α SM-actin免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)行細(xì)胞鑒定。
　　3.分組:取第4至6代細(xì)胞，用無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)同步化后隨機(jī)分成5組，(1)正常對照組(Normal contral組):在常氧條件(37℃，21％O2，5％CO2)下培養(yǎng)24h

2、;(2)物理缺氧組（Three gas incubator組）:在三氣培養(yǎng)箱(37℃，3％O2，5％CO2，92％N2)下培養(yǎng)24h;(3)低濃度亞硫酸鈉缺氧組（1.5g/L SS組）:在常氧條件下培養(yǎng)24h，培養(yǎng)液中加入1.5g/L亞硫酸鈉;(4)中濃度亞硫酸鈉缺氧組（2.0g/L SS組）:在常氧條件下培養(yǎng)24h，培養(yǎng)液中加入2.0g/L亞硫酸鈉;(5)高濃度亞硫酸鈉缺氧組(3.0g/LSS組):在常氧條件下培養(yǎng)24h，培養(yǎng)液中加入

3、3.0g/L亞硫酸鈉。
　　4.用H-E染色法觀察細(xì)胞形態(tài);MTT比色法檢測細(xì)胞活力;激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞活性氧;RT-PCR檢測HIF-1a基因的表達(dá);WestemBlotting檢測HIF-1a蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:1.肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)
　　分離消化的細(xì)胞經(jīng)20％牛胎血清培養(yǎng)基培養(yǎng)2-3d后，單個(gè)的細(xì)胞貼壁并且逐漸有細(xì)胞從未消化完全的組織塊中爬出，細(xì)胞貼壁生長，呈長梭形，8-10d后細(xì)胞逐漸融合，呈現(xiàn)

4、典型的“峰-谷”狀生長特點(diǎn)。
　　2.肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的鑒定
　　α-SM actin免疫熒光染色顯示細(xì)胞質(zhì)中有較多與細(xì)胞縱軸相平行的絲狀綠色熒光，即為平滑肌細(xì)胞特有的肌動(dòng)蛋白，而且＞95％的細(xì)胞呈陽性，為肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞
　　3.各組細(xì)胞活性的變化
　　正常組細(xì)胞的吸光度值與物理缺氧組相比較低（P＜0.05）。而1.5g/L SS組的吸光度值與物理缺氧組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），2.0g/L SS組和3

5、.0g/L SS組的吸光度值與物理缺氧組比較均降低（P＜0.05)
　　4.各組HE染色結(jié)果的比較
　　與Normal contral組比，Three gas incubator組和1.5g/L SS組的細(xì)胞形態(tài)無顯著改變，而2.0g/L SS組的細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡的細(xì)胞，而3.0g/L SS組的凋亡細(xì)胞明顯比2.0g/L SS組多。
　　5.各組細(xì)胞活性氧的變化
　　正常組細(xì)胞體內(nèi)的活性氧轉(zhuǎn)換成平均熒光強(qiáng)度后比物

6、理缺氧組低(P＜0.05)，而1.5g/L SS組和2.0g/L SS組的平均熒光強(qiáng)度與物理缺氧組相比隨著濃度的升高遞增（P＜0.05)，但是3.0g/L SS組的平均熒光強(qiáng)度比3.0g/L SS組的要低(P＜0.05)。
　　6.各組HIF-1α基因表達(dá)量的變化
　　與Normal contral組比，Three gas incubator組的HIF-1α mRNA含量明顯增加（P＜0.05)，1.5g/L SS組與Thr

7、ee gas incubator組相比，HIF-1α的mRNA含量略微有所上升(P＜0.05)，2.0g/L SS組和3.0g/L SS組與3.0g/L SS組相比，表達(dá)量顯著上升（P＜0.05)，而且呈劑量依賴性。
　　7.各組HIF-1α蛋白含量的變化
　　與Normal contral組相比，Three gas incubator組的HIF-1α的蛋白表達(dá)量上升（P＜0.05)，1.5g/L SS組與Three gas

8、 incubator組相比，蛋白表達(dá)量小幅度上升(P＜0.05)，2.0g/L SS組和3.0g/L SS組與Three gas incubator組相比，蛋白表達(dá)量明顯增加（P＜0.05)，而且呈濃度依賴性。
　　結(jié)論:1、1.5g/L亞硫酸鈉對細(xì)胞基本無影響，但隨著亞硫酸鈉濃度的增加，其對細(xì)胞逐漸出現(xiàn)毒性作用，并隨亞硫酸鈉的濃度增高，毒性作用增強(qiáng)。
　　2、亞硫酸鈉缺氧組的缺氧程度優(yōu)于三氣培養(yǎng)箱物理缺氧組，而且缺氧程度隨