水稻條紋病毒的分子生物學(xué)研究.pdf

1、水稻條紋葉枯病是目前我國(guó)水稻生產(chǎn)上最具威脅性的病毒病，曾多次在不同省市出現(xiàn)大規(guī)模的爆發(fā)，造成水稻的嚴(yán)重減產(chǎn)。為了更好的了解水稻條紋病毒(Rice stripevirus，RSV)的危害流行，本論文圍繞RSV在不同寄主中的群體變異和抵抗RNA沉默的機(jī)制方面開展了相關(guān)研究;
　　 1來(lái)自6個(gè)不同地區(qū)RSV分離物的基因組序列測(cè)定及東亞地區(qū)RSV群體序列分析
　　 測(cè)定了來(lái)自云南、浙江、江蘇和遼寧四個(gè)省份的共6個(gè)RSV分離物的基

2、因組全序列.并將它們和其它從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)基因庫(kù)中下載的我國(guó)、日本和韓國(guó)的RSV分離物序列進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果表明東亞地區(qū)的RSV分離物的遺傳多樣性相對(duì)較低，所有的基因都檢測(cè)到了負(fù)向（凈化）選擇壓。而其中我國(guó)云南省內(nèi)的RSV分離物的遺傳多樣性則高于東亞其它地區(qū)，并且在系統(tǒng)進(jìn)化樹分析上發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)分支的分離物全都來(lái)自云南。
　　 2通過(guò)高通量測(cè)序分析RSV在不同寄主的群體變異和分

3、子進(jìn)化
　　 通過(guò)高通量測(cè)序測(cè)定了在發(fā)病水稻個(gè)體中的RSV準(zhǔn)種的群體序列，同時(shí)將該群體轉(zhuǎn)移至本氏煙（非RSV的自然寄主）中后再測(cè)定群體序列。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)移至本氏煙之后，RSV準(zhǔn)種的群體變異程度大大增加，并且準(zhǔn)種的結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的改變，堿基的組成成分中GC的含量也有下降的趨勢(shì)。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，RSV在轉(zhuǎn)移至本氏煙之后，RdRP、NSvc2和CP三個(gè)基因中都檢測(cè)到了正向選擇壓的信號(hào)，而在自然寄主水稻中則沒有這種現(xiàn)象。本試驗(yàn)

4、的結(jié)果表明高通量測(cè)序技術(shù)是一個(gè)研究植物RNA病毒的準(zhǔn)種群體遺傳學(xué)中的強(qiáng)力手段.
　　 3在不同寄主中RSV來(lái)源的小干擾RNA的鑒定
　　 利用Solexa平臺(tái)第二代測(cè)序技術(shù)測(cè)定了RSV來(lái)源的小RNA(small RNAs，sRNA)在自然寄主水稻和非自然寄主本氏煙中的產(chǎn)生情況。在侵染的水稻和本氏煙中，RSV來(lái)源的sRNA以20-22 nt為主，而23和24 nt的則很少.將sRNA匹配到RSV的基因組上發(fā)現(xiàn)，其分布是不均

5、勻的:在本氏煙中RSV來(lái)源的sRNA主要分布在RNA4上;而在水稻中則主要分布在RNA3和RNA4上.這兩者相似的地方是sRNA分布的峰值都出現(xiàn)在RSV基因組RNA的兩端。對(duì)sRNA的極性分析發(fā)現(xiàn)，在水稻中sRNA的極性是傾向于來(lái)自病毒鏈的，而在本氏煙中則接近1∶1。并且不同長(zhǎng)度的sRNA的極性也有不同，在兩種寄主中23 nt和24 nt的sRNA相比20-22 nt的sRNA都更加傾向于來(lái)自病毒鏈。
　　 4 dsRNA介導(dǎo)的

6、抗RSV基因工程研究
　　 以在水稻體內(nèi)轉(zhuǎn)錄出RNA沉默的高效誘導(dǎo)因子-dsRNA為目標(biāo)，將RSV RdRP基因部分序列以反向重復(fù)的方式插入到植物表達(dá)載體pCAMBIA1301上35S啟動(dòng)子下游，形成能表達(dá)hairpin-RNA的重組載體。再通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻，并對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的抗性水平進(jìn)行了檢測(cè)，在12個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中篩選到6不對(duì)RSV具有抗性，并能在T1和T2代中穩(wěn)定遺傳。
　　 5 RSV NS3蛋白的寄主因子篩

7、選
　　 以NS3蛋白為誘餌，利用酵母雙雜交系統(tǒng)從水稻cDNA文庫(kù)中篩選與NS3蛋白互作的水稻寄主因子。將NS3基因構(gòu)建到誘餌質(zhì)粒pGBK-T7上并導(dǎo)入酵母菌Y2HGold中，將其與帶有水稻cDNA文庫(kù)質(zhì)粒的酵母菌Y187融合，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基和ABA抗生素篩選，并進(jìn)一步通過(guò)回轉(zhuǎn)驗(yàn)證，最終確定了OsSO蛋白是與NS3蛋白互作的水稻寄主因子之一.通過(guò)雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)驗(yàn)證了OsSO和NS蛋白在植物體內(nèi)的互作情況，發(fā)現(xiàn)其互作在細(xì)