益氣化瘀方改善子宮內膜異位癥模型大鼠內膜容受性的實驗研究.pdf

1、目的：
　　建立子宮內膜異位癥大鼠模型，采用中藥復方“益氣化瘀方”進行干預。從功能學角度觀察益氣化瘀方對模型大鼠妊娠功能的影響，從組織病理學和分子生物學角度觀察益氣化瘀方對模型大鼠子宮內膜容受性的影響及對異位內膜生長的影響。探討益氣化瘀方治療子宮內膜異位癥同時改善子宮內膜容受性，提高妊娠功能的作用機制，為進一步臨床應用提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　通過手術切除大鼠右側子宮，剪取內膜組織塊移植到腸系膜建立子宮內膜異位癥

2、大鼠模型。將造模成功的大鼠隨機分為益氣化瘀方組、孕三烯酮組、模型組，另設假手術組。各組給藥方法如下：益氣化瘀方組予益氣化瘀方混懸液（相當于生藥3.55g/ml），按4ml/（Kg·d）連續(xù)灌胃6周；孕三烯酮組予孕三烯酮混懸液（0.1mg/ml），按4ml/（Kg·d）連續(xù)灌胃4周后以等體積滅菌蒸餾水連續(xù)灌胃2周；模型組及假手術組均予滅菌蒸餾水，按4ml/（Kg·d）連續(xù)灌胃6周。
　　實驗研究分為三個部分。第一部分實驗觀察益氣化瘀

3、方對子宮內膜異位癥模型大鼠妊娠功能的影響。在藥物干預結束后于動情期將雌雄大鼠以2:1比例合籠，以發(fā)現(xiàn)陰栓或陰道脫落細胞涂片發(fā)現(xiàn)精子當日記為妊娠第1天，于雌鼠妊娠第16天采集標本。統(tǒng)計各組妊娠雌鼠數(shù)、妊娠雌鼠單側子宮著床數(shù)，電子天平稱量各胚胎及胎盤重量，平行切片法計數(shù)左側卵巢妊娠黃體數(shù)，計算大鼠妊娠率、著床率。第二部分實驗探討益氣化瘀方改善子宮內膜容受性，促進胚胎著床的作用機制。在藥物干預結束后于動情期將雌雄大鼠以2:1比例合籠，于雌鼠妊

4、娠第4天采集標本。ELISA法檢測大鼠血清雌二醇（E2）與孕酮（P）水平，免疫組化 SP法和蛋白質免疫印跡法分別檢測大鼠子宮內膜雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、白血病抑制因子（LIF）、整合素αυβ3（αυβ3）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達。第三部分實驗探討益氣化瘀方抑制異位內膜生長的作用機制。用游標卡尺測量大鼠干預前、后異位囊腫直徑，免疫組化SP法檢測大鼠異位內膜ER、PR、αυβ3、MMP-9、基質金屬蛋白酶組織

5、抑制物-1（TIMP-1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Casepase-9）表達。
　　免疫組化切片放大400倍，采用Image-Pro Plus6.0軟件進行圖像分析，測量特異蛋白表達陽性區(qū)域的累計光密度（IOD）值及區(qū)域面積（area），以平均光密度（IOD/area）代表蛋白表達強度，結果記錄為平均光密度值。
　　Western blot采用Bio-rad XRS+成像儀采集圖像，測定目標條帶灰度值，選擇β-acti

6、n為蛋白內參，結果記錄為目標條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。
　　應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)加減標準差（-x±s）表示。計量資料經參數(shù)檢驗，多組間比較采用單因素方差分析或秩和檢驗，兩兩組間比較采用LSD或Kruskal-Wallis檢驗，組內差異采用配對樣本 t檢驗或 Wilcoxon Signed-Rank檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。設定檢驗水準α=0.05，P<0.05

7、即為差異有顯著性意義。
　　結果：
　　1.益氣化瘀方對子宮內膜異位癥模型大鼠妊娠功能的影響
　　模型組排卵數(shù)、著床數(shù)、著床率、胚胎重量及胎盤重量均低于假手術組，益氣化瘀方組排卵數(shù)、著床數(shù)、著床率、胚胎重量及胎盤重量均高于模型組和孕三烯酮組，差異有顯著性意義（P<0.05）；而孕三烯酮組排卵數(shù)、著床數(shù)、著床率、胚胎重量及胎盤重量與模型組差異無顯著性意義（P>0.05）。
　　2.益氣化瘀方對子宮內膜異位癥模型大鼠

8、圍著床期血清 E2、P水平的影響
　　益氣化瘀方組 E2水平高于模型組和孕三烯酮組，差異有顯著性意義（P<0.05）；而孕三烯酮組E2水平與模型組差異無顯著性意義（P>0.05）。模型組 P水平低于假手術組，益氣化瘀方組 P水平高于模型組和孕三烯酮組，差異有顯著性意義（P<0.05）；但孕三烯酮組P水平與模型組差異無顯著性意義（P>0.05）。
　　3.益氣化瘀方對子宮內膜異位癥模型大鼠子宮內膜容受性的影響
　　模型組

9、圍著床期子宮內膜ER表達高于假手術組，益氣化瘀方組和孕三烯酮組ER表達均低于模型組，益氣化瘀方組ER表達高于孕三烯酮組，差異有顯著性意義（P<0.05）。模型組圍著床期子宮內膜 PR表達高于假手術組，益氣化瘀方組和孕三烯酮組PR表達均低于模型組，益氣化瘀方組 PR表達低于孕三烯酮組，差異有顯著性意義（P<0.05）。模型組圍著床期子宮內膜 LIF、αυβ3、MMP-9表達均低于假手術組，益氣化瘀方組LIF、αυβ3、MMP-9表達均高于

10、模型組，差異有顯著性意義（P<0.05）；但孕三烯酮組LIF、αυβ3、MMP-9表達與模型組差異無顯著性意義（P>0.05）。
　　4.益氣化瘀方對子宮內膜異位癥模型大鼠異位內膜的影響
　　益氣化瘀方組和孕三烯酮組干預后異位囊腫直徑均較干預前減小，差異有顯著性意義（P<0.05）；模型組干預前后異位囊腫直徑比較差異無顯著性意義（P>0.05）。
　　益氣化瘀方組和孕三烯酮組異位內膜ER、PR表達均低于模型組，差異有顯

11、著性意義（P<0.05）；而益氣化瘀方組和孕三烯酮組異位內膜ER、PR表達差異均無顯著性意義（P>0.05）。益氣化瘀方組和孕三烯酮組異位內膜αυβ3、MMP-9表達均低于模型組，而TIMP-1表達均高于模型組，差異有顯著性意義（P<0.05）；但益氣化瘀方組和孕三烯酮組異位內膜αυβ3、MMP-9、TIMP-1表達均差異無顯著性意義（P>0.05）。益氣化瘀方組和孕三烯酮組異位內膜 Casepase-9表達均高于模型組，差異有顯著性意

12、義（P<0.05）；但益氣化瘀方組和孕三烯酮組Casepase-9表達差異無顯著性意義（P<0.05）。
　　結論：
　　1.子宮內膜異位癥模型大鼠妊娠功能偏低，益氣化瘀方能有效提高其排卵數(shù)和著床率，并能促進胚胎發(fā)育。
　　2.益氣化瘀方能有效提升子宮內膜異位癥模型大鼠圍著床期P水平，降調子宮內膜上PR表達，并能上調子宮內膜中LIF、αυβ3、MMP-9的表達，提示其可通過調節(jié)子宮內膜容受性，促進胚胎著床而改善子宮內膜