組成型過量表達(dá)hTERT對(duì)Vero細(xì)胞體外培養(yǎng)生物學(xué)特性的影響.pdf

1、Vero細(xì)胞是WHO和我國(guó)生物制品規(guī)程認(rèn)可使用的人用疫苗生產(chǎn)細(xì)胞系。Vero細(xì)胞廣泛的病毒感染譜、高效的病毒擴(kuò)殖效率、無(wú)致瘤性和便于迅速擴(kuò)大培養(yǎng)等優(yōu)勢(shì)使其成為目前世界人用疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞株之一。但是，Vero細(xì)胞自身高度的貼壁性和對(duì)血清的依賴以及在生物反應(yīng)器中的大量凋亡等缺陷也嚴(yán)重制約著現(xiàn)行的疫苗生產(chǎn)工藝。
　　 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT

2、)被認(rèn)為是端粒酶的重要組成部分和限速因子。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，hTERT除參與形成端粒酶復(fù)合物、延長(zhǎng)端粒長(zhǎng)度和保證細(xì)胞分裂過程中的基因組穩(wěn)定性之外，可以有效減少惡劣培養(yǎng)環(huán)境帶來(lái)的細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞的生存能力。組成型過量表達(dá)hTERT是值得關(guān)注和探索的改善細(xì)胞培養(yǎng)特性、提高哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)質(zhì)量的有效技術(shù)途徑。
　　 本課題的研究目標(biāo)是建立能夠穩(wěn)定高水平表達(dá)hTERT的Vero細(xì)胞系，考察過表達(dá)hTERT及不同的hTERT表達(dá)水平對(duì)

3、Vero細(xì)胞體外培養(yǎng)生物學(xué)特性帶來(lái)的影響。
　　 以EGFP為報(bào)告基因，借助流式細(xì)胞分析驗(yàn)證了真核表達(dá)載體phEF-ChMAR-hyg在Vero細(xì)胞的表達(dá)效果，構(gòu)建了hTERT高效表達(dá)載體phEF-ChMAR-hyg-hTERT。采用RT-PCR和Real-Time PCR分析phEF-ChMAR-hyg-hTERT轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞克隆hTERT mRNA的表達(dá)水平，從中選取hTERT mRNA相對(duì)表達(dá)水平是野生型Vero細(xì)胞的35

4、.26倍和6.14倍的hTERT組成型過量表達(dá)Vero細(xì)胞系，T1和T3。采用Western Blot分析和TRAP-PCR的方法驗(yàn)證了hTERT mRNA、蛋白水平和功能表達(dá)的一致性及T1、T3細(xì)胞組成型過量表達(dá)hTERT的穩(wěn)定性。
　　 以活細(xì)胞密度和細(xì)胞活力為主要觀察指標(biāo)，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)和貼附伸展動(dòng)態(tài)，考察hTERT組成型過量表達(dá)Vero細(xì)胞T1和T3在靜止貼附培養(yǎng)、微載體固定化培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)體系中的細(xì)胞生長(zhǎng)。hTERT的組

5、成型過量表達(dá)在降低Vero細(xì)胞的貼附伸展能力的同時(shí)，賦予了T1和T3細(xì)胞，尤其是T1細(xì)胞非貼附依賴性生長(zhǎng)的能力。同時(shí)，hTERT的組成型過量表達(dá)降低了Vero細(xì)胞體外培養(yǎng)對(duì)血清的依賴程度，提高了細(xì)胞批次培養(yǎng)后期的細(xì)胞活力和活細(xì)胞密度。
　　 以葡萄糖比消耗速率(qGlu)、乳酸比生成速率(qLac)、乳酸轉(zhuǎn)化率(YLac/Glu)和谷氨酰胺比消耗率(qGln)為反映細(xì)胞代謝的主要觀察指標(biāo)，考察T1、T3細(xì)胞和野生型Vero細(xì)胞在