氣道上皮高表達mCLCA3與哮喘小鼠氣道炎癥的關(guān)系.pdf

1、第一部分：
　　 目的：研究哮喘相關(guān)基因mCLCA3 在哮喘小鼠模型中的梯度變化及其與Th1/Th2細胞因子和趨化因子的關(guān)系，并分析其在哮喘氣道炎癥中的作用。
　　 方法：30 只SPF 級BALB/C小鼠隨機分為五組，每組6 只（n=6）：D(致敏而未激發(fā)），E(激發(fā)1天），F(xiàn)(激發(fā)3天），G(激發(fā)5天），H(激發(fā)7天）。通過RT-PCR和免疫組化分別檢測肺組織中mCLCA3的mRNA和蛋白表達水平及蛋白定位。采用肺組

2、織切片的HE染色、肺泡灌洗液中炎癥細胞分類計數(shù)、流式細胞術(shù)檢測肺組織單個核細胞中CD4+T 淋巴細胞比例改變來評價肺部炎癥細胞浸潤情況。RT-PCR法和流式細胞術(shù)胞內(nèi)因子染色檢測肺組織IL-4和IFN-γ的mRNA和蛋白表達。ELISA 檢測炎癥局部不同趨化因子的蛋白表達水平。
　　 結(jié)果：RT-PCR和免疫組化結(jié)果均表明激發(fā)組較未激發(fā)組mCLCA3表達增加，并且mCLCA3的表達量隨激發(fā)次數(shù)增加而增加具有激發(fā)時間依賴性(p＜0

3、.05)且免疫組化提示mCLCA3 僅僅表達于哮喘小鼠的氣道上皮。與未激發(fā)組小鼠相比（D組），激發(fā)組的小鼠肺組織和肺泡灌洗液中的炎癥細胞浸潤數(shù)均顯著增加。
　　 隨著激發(fā)次數(shù)的增多，肺組織中Th1和Th2 細胞因子IL-4和IFN-γ均有不同程度升高，其中激發(fā)最多組（H組）IL-4 與其余各組差異有統(tǒng)計學意義而各組IFN-γ差異無統(tǒng)計學意義。ELISA 結(jié)果顯示隨著激發(fā)次數(shù)的增加小鼠BALFCCL17、CCL22均有增加趨勢，其

4、中G、H組CCL17，H組CCL22 差異較其余組有統(tǒng)計學意義；激發(fā)多次的小鼠（F、G、H組）BALF中CCL5 有增加趨勢，但增加的差異無統(tǒng)計學意義。相關(guān)性分析表明：mCLCA3 與BALF中CCL17(r=0.584，p<0.01）、CCL22（r=0.461，p<0.05）均成正相關(guān)；E、F、G組CCL5 與mCLCA3(r=0.736，p<0.01）亦成正相關(guān)。mCLCA3 與BALF中總炎癥細胞（r=0.393，p<0.05）

5、、嗜酸性粒細胞（r=0.529，p<0.01）正相關(guān)，與肺組織中CD4 +T細胞（r=-0.558，p<0.05）負相關(guān)；mCLCA3 與肺組織淋巴細胞、單核-巨噬細胞及細胞因子IL-4和IFN-γmRNA 水平均無明顯相關(guān)性。
　　 結(jié)論：哮喘小鼠模型氣道上皮中增加的mCLCA3表達可能通過參與氣道上皮細胞趨化因子的分泌而介導炎癥局部炎癥細胞的浸潤從而在氣道炎癥的發(fā)展中起重要作用。這一發(fā)現(xiàn)為我們進一步研究mCLCA3 在肺組織

6、炎癥中的作用提供了新的線索。
　　 第二部分：
　　 目的：構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒 pDC315-SPA-mCLCA3 融合基因表達載體，分析其在氣道上皮細胞系的靶向表達。
　　 方法：PCR法從 PGL-SPA和 pCR-BluntII-TOPO 載體中克隆全長2948bp的SPA-mCLCA3基因序列并將其亞克隆入pDC315-EGFP 載體，構(gòu)建pDC315-SPA-mCLCA3 靶向表達載體。測序鑒定正確后分

7、別轉(zhuǎn)染氣道上皮細胞系（H441）和非氣道上皮細胞系（293）。每種細胞分pDC315-EGFP組（對照組：GFP 陽性，mCLCA3 陰性）和 pDC315-SPA-mCLCA3組（mCLCA3 陽性組），分析mCLCA3 在不同上皮細胞的表達水平。
　　 結(jié)果：測序結(jié)果證實成功構(gòu)建含有氣道上皮細胞特異性啟動子SPA的mCLCA3 重組質(zhì)粒。靶向表達分析表明mCLCA3 mRNA 在高表達SPA的氣道上皮細胞系（H441）中表達