BCG及其相關(guān)組分對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥和氣道反應(yīng)性的影響.pdf

1、全文分為二部分: 第一部分氣道反應(yīng)性檢測(cè)方法及小鼠哮喘模型的建立 目的：建立小鼠氣道反應(yīng)性檢測(cè)方法及OVA致敏的BALB/c小鼠哮喘模型。 方法：(1)氣道反應(yīng)性的測(cè)定：用Buxco小鼠有創(chuàng)肺功能儀檢測(cè)小鼠的氣道反應(yīng)性。觀察10只OVA致敏、激發(fā)的小鼠及10只生理鹽水對(duì)照小鼠乙酰甲膽堿激發(fā)后氣道阻力(RI)的變化。小鼠麻醉后行氣管插管，連接呼吸機(jī)和霧化裝置。依次霧化0.78～200mg/ml范圍內(nèi)倍增濃度的乙酰甲

2、膽堿，觀測(cè)小鼠氣道阻力的變化，直到RI比基礎(chǔ)值增高1倍時(shí)停止霧化，錄此時(shí)的乙酰甲膽堿濃度，即PC100。將PC100對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換成Log2(10PC100)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Log2(10PC100)數(shù)值越大氣道反應(yīng)性越低，反之，氣道反應(yīng)性越高。(2)小鼠模型的建立：20只BALB/c雌性小鼠，隨機(jī)分為2組：生理鹽水(NS)對(duì)照組和卵蛋白(OVA)模型組。第0，7，14天腹腔注射卵蛋白致敏，第28天開始滴鼻激發(fā)，每天1次，連續(xù)3天。在末次激發(fā)

3、48小時(shí)后，分別檢測(cè)小鼠的下列指標(biāo)：氣道高反應(yīng)性，支氣管肺泡灌洗液(BALF)細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類，肺組織炎癥及氣道粘液分泌情況。(3)經(jīng)鼻激發(fā)藥液分布：探討麻醉對(duì)滴鼻給藥肺組織分布的影響，12只BALB/c雌鼠隨機(jī)分成麻醉組和清醒組，每只小鼠50μl伊文氏蘭(EBD)滴鼻后1小時(shí)處死，留取肺、支氣管、胃和脾，用1ml甲酰胺抽提EBD后，通過測(cè)定吸光度計(jì)算各器官的EBD含量。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件包。 結(jié)

4、果：1、氣道反應(yīng)性的測(cè)定：模型組和對(duì)照組的氣道阻力(RI)均有隨乙酰甲膽堿濃度升高而增加的趨勢(shì)，模型組在較低濃度時(shí)升高明顯。模型組PC100均≤6.25mg/ml，對(duì)照組PC100均≥6.25mg/ml。模型組Log2(10PC100)值(4.15±0.58)顯著低于對(duì)照組(8.74±1.58)(P＜0.001)，模型組氣道反應(yīng)性顯著高于對(duì)照組。 2、經(jīng)鼻給EBD后藥物的分布：麻醉組氣管和肺組織EBD含量分別為：(9.55±5.

5、09)μg/ml、(44.60±3.25)μg/ml，清醒組氣管和肺組織EBD含量[分別為：(0.19±0.16)μg/ml、(5.27±0.97)μg/ml，麻醉組氣管和肺組織EBD含量顯著高于清醒組(P＜0.01)。麻醉組肺組織EBD含量顯著高于同組氣管、胃和脾EBD含量[分別為：(9.55±5.09)μg/ml、(9.64±6.74)μg/ml、(3.49±2.03)μg/ml](P＜0.01)。 3、氣道炎癥：生理鹽水對(duì)

6、照組嗜酸粒細(xì)胞百分比和白細(xì)胞總數(shù)分別為(0.05±0.17)％、(1.46±0.60)×105/ml，OVA致敏模型組支氣管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸粒細(xì)胞百分比和白細(xì)胞總數(shù)分別為(72.22±7.87)％、(12.82±1.74)×105/ml，模型組與對(duì)照組相比明顯增高(P＜0.01)；小鼠肺組織肉眼觀可見：模型組小鼠肺臟體積較對(duì)照組明顯增大，肺葉蒼白、腫脹；光鏡下肺組織：HE染色可見支氣管及血管周圍大量炎性細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)及肺泡

7、腔內(nèi)可見嗜酸性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞浸潤。PAS染色可見氣道上皮杯狀細(xì)胞增生肥大，并有大量粘液分泌。 結(jié)論：1、通過小鼠有創(chuàng)肺功能儀測(cè)定PC100，成功建立小鼠氣道反應(yīng)性的檢測(cè)方法。 2、麻醉狀態(tài)下滴鼻激發(fā)OVA成功建立BALB/c小鼠哮喘模型。 第二部分BCG及提取組分對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥和氣道反應(yīng)性的影響 目的：觀察BCG及相關(guān)組分干預(yù)哮喘小鼠后，小鼠氣道炎癥及氣道反應(yīng)性的變化。 方法：BALB/c雌

8、鼠隨機(jī)分為OVA模型組、NS對(duì)照組、BCG干預(yù)組、BCG-DNA干預(yù)組、BCG-LPS干預(yù)組和激素組。除NS對(duì)照組外，其余各組均以O(shè)VA致敏、激發(fā)。首次致敏時(shí)間為0天，小鼠在第0、7、14天腹腔注射致敏；第28、29、30天滴鼻激發(fā)，每天一次。激素組分為地塞米松(Dex)組和布地奈德(Bud)組，每次激發(fā)前1小時(shí)給予腹腔注射Dex5mg/kg或經(jīng)鼻滴入Bud350μg/kg；按首次致敏后第17天給予BCG劑量的不同分為3組：105CFU

9、s干預(yù)組(BCG組1)、104CFUs干預(yù)組(BCG組2)和103CFUs干預(yù)組(BCG組3)，按給予BCG105CFUs時(shí)間的不同分為3組：致敏后第17天干預(yù)組(BCG組1)、致敏后第10天干預(yù)組(BCG組4)和致敏前7天干預(yù)組(BCG組5)；按首次致敏后第10天給予BCG-DNA劑量不同分為3組：1000μg干預(yù)組(DNA組1)、100μg干預(yù)組(DNA組2)、10μg干預(yù)組(DNA組3)，按給予100μgBCG-DNA時(shí)間的不同分

10、為3組：首次致敏前7天干預(yù)組(DNA組4)、首次致敏后第10天干預(yù)組(DNA組2)和首次致敏后第17天干預(yù)組(DNA組5)；按首次致敏后第10天給予BCG-LPS劑量不同分為3組：1000μg干預(yù)組(LPS組1)、100μg干預(yù)組(LPS組2)、10μg干預(yù)組(LPS組3)，按給予100μgBCG-LPS時(shí)間的不同分為3組：首次致敏前7天干預(yù)組(LPS組4)、首次致敏后第10天干預(yù)組(LPS組2)和首次致敏后第17天干預(yù)組(LPS組5)

11、。在末次激發(fā)48小時(shí)后，通過乙酰甲膽堿激發(fā)試驗(yàn)測(cè)定PC100并用該指標(biāo)對(duì)小鼠氣道反應(yīng)性進(jìn)行評(píng)價(jià)；通過BALF細(xì)胞學(xué)和肺組織病理檢測(cè)對(duì)小鼠氣道炎癥進(jìn)行評(píng)價(jià)。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)采用SPSS12.0單因素方差分析(ANOVA)。 結(jié)果：1.激素治療組(1)氣道反應(yīng)性：Dex組中Log2(10PC100)值(7.97±1.37)，與OVA模型組(3.93±0.57)相比明顯增大(P＜0.001)。(2)氣道炎癥：Dex及Bud組中BALFEos

12、％[分別為：(18.00±5.35)％和(38.75±9.53)％]，與OVA模型組[(77.13±4.58)％]相比明顯降低(P＜0.01)。 2.BCG干預(yù)組(1)氣道反應(yīng)性：BCG組5中Log2(10PC100)值(8.39±1.62)，與OVA模型組相比明顯增大(P＜0.01)。(2)氣道炎癥：BCG組1、BCG組2、BCG組4和BCG組5中BALFEos％[分別為：(54.64±10.02)％、(63.13±4.32)

13、％、(54.83±5.24)％和(42.92±9.41)％]，與OVA模型組相比明顯下降(P＜0.01)；BCG組3中BALFEos％與OVA模型組差異不顯著(P＞0.05)。 3.BCG-DNA干預(yù)組(1)氣道反應(yīng)性：DNA組1和DNA組4中Log2(10PC100)值[分別為：(10.39±1.13)、(9.97±1.22)]與OVA模型組相比明顯增大(P＜0.001，P＜0.01)(2)氣道炎癥：DNA組1、DNA組2、D

14、NA組3、DNA組4和DNA組5中BALFEos％[分別為：(22.07±6.07)％、(44.50±6.55)％、(59.57±4.36)％、(32.45±6.75)％和(66.38±3.89)％]，與OVA模型組相比明顯下降(P＜0.01)；DNA組1中BALFEos％明顯與DNA組2和DNA組3相比明顯下降(P＜0.01)；DNA組4中BALFEos％低于DNA組2和DNA組5(P＜0.01)。 4.BCG-LPS干預(yù)組(

15、1)氣道反應(yīng)性：LPS組1、LPS組2和LPS組4中Log2(10PC100)值[分別為：(10.13±1.60)、(9.37±1.82)和(9.39±2.07)]與OVA模型組相比明顯增高(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01)。(2)氣道炎癥：LPS組1、LPS組2、LPS組3、LPS組4和LPS組5中BALFEos％[分別為：(34.63±4.51)％、(44.14±3.80)％、(60.62±7.00)％、(34.58±8.

16、65)％和(60.50±4.94)％]，與OVA模型組相比明顯下降(P＜0.01)；LPS組1中BALFEos％明顯低于LPS組2和LPS組3(P＜0.01)；LPS組4中BALFEos％明顯低于LPS組2和LPS組5(P＜0.01)。 5.DNA組1、LPS組1與Dex組相比，LPS組1BALFEos％顯著高于Dex組(P＜0.01)；BCG組5、DNA組4和LPS組4之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 6.BCG

17、、BCG-DNA及BCG-LPS干預(yù)后小鼠肺組織的變化：Dex組氣道上皮較完整，氣道和血管周圍炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕，氣道粘液分泌減少。BCG及其組分干預(yù)后血管及氣管仍可見炎性細(xì)胞浸潤，大劑量或早期干預(yù)后血管和氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，所有干預(yù)組氣道粘膜都可見粘液分泌，但與哮喘組相比未見明顯變化。 結(jié)論：BCG、BCG-DNA及BCG-LPS可以降低哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性和氣道嗜酸細(xì)胞炎癥，其藥效存在明顯的量效性和時(shí)效性，尤其