白藜蘆醇對(duì)RSV感染所致氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的作用及其機(jī)制.pdf

1、本文研究了白藜蘆醇對(duì)RSV感染所致氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的作用及其機(jī)制。本研究分為三個(gè)部分：
　　 第一部分：環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫低下BALB/c小鼠RSV感染動(dòng)物模型的建立。
　　 目的：為了建立RSV感染動(dòng)物模型,采用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫低下的BALB/c小鼠,觀察是否對(duì)低濃度RSV的易感性,此模型更接近臨床患者感染RSV的情況。
　　 方法：BALB/c小鼠分為Control(PBS)組、PBS+RSV組及環(huán)磷酰胺

2、+RSV組(CYP+RSV組),每組10只。CYP+RSV組給予環(huán)磷酰胺100mg/kg腹腔注射,Control組、PBS+RSV組給予同劑量PBS腹腔注射,每天稱體重。環(huán)磷酰胺注射第5d,在10％水合氯醛3ml/kg麻醉下,PBS+RSV組、CYP+RSV組給予RSV3.4×106PFU/ml,100μl滴鼻,Control組給予培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞上清液100μ l,隨機(jī)選取每組中的3只小鼠稱體重至RSV感染后15d,其余均在RSV感

3、染后第5天處死取標(biāo)本。肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類,H&E染色觀察肺組織病理炎癥并進(jìn)行炎癥評(píng)分,空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠肺組織勻漿RSV病毒滴度,為進(jìn)一步探討環(huán)磷酰胺對(duì)BALB/c小鼠淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng),采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)肺淋巴細(xì)胞分類百分比。
　　 結(jié)果：CYP+RSV組體重比PBS+RSV組明顯降低,BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示CYP+RSV組小鼠比PBS+RSV組小鼠細(xì)胞總數(shù)明顯增多,且淋巴細(xì)胞比例也增高,巨噬細(xì)胞比例降低;H&E染色病理炎

4、癥CYP+RSV組小鼠較PBS+RSV組小鼠白細(xì)胞浸潤(rùn)更加嚴(yán)重,病理炎癥評(píng)分較高;CYP+RSV組小鼠肺組織勻漿病毒滴度比PBS+RSV組小鼠肺組織滴度增高;流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示環(huán)磷酰胺處理小鼠后CD19比例明顯降低,CD49b比例有所增加,CD3比例兩組比較無(wú)明顯差異;RSV感染后,CYP+RSV組較PBS+RSV組CD19比例顯著降低,但是與CYP組相比無(wú)明顯差異,CD49b比例CYP+RSV組與PBS+RSV組無(wú)明顯差異,CD3比

5、例CYP+RSV組與CYP組及PBS+RSV組相比有所升高。
　　 結(jié)論：環(huán)磷酰胺處理后誘導(dǎo)免疫低下小鼠感染RSV肺組織炎癥更重,病毒滴度較高,提示免疫低下小鼠對(duì)低濃度RSV易感,可能與環(huán)磷酰胺處理后抑制小鼠肺B淋巴細(xì)胞,使得免疫反應(yīng)降低,抗體的產(chǎn)生減少有關(guān)。
　　 第二部分：白藜蘆醇對(duì)RSV感染誘發(fā)氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的作用。
　　 目的：觀察白藜蘆醇對(duì)RSV感染環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫低下小鼠氣道炎癥和氣道高反應(yīng)

6、性的變化,研究白藜蘆醇對(duì)RSV誘導(dǎo)的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的作用。
　　 方法：BALB/c小鼠分為Control組、RSV+PBS組、RSV+RES組,每組8只:RSV+RES組:環(huán)磷酰胺注射第5d,感染RSV,1-2h后給予白藜蘆醇30mg/kg腹腔注射,連續(xù)給藥5d。RSV+PBS組:環(huán)磷酰胺注射第5d,感染RSV,1-2h后給予PBS(劑量同白藜蘆醇)腹腔注射,連續(xù)注射5d。Control組:環(huán)磷酰胺注射第5d,RSV病

7、毒對(duì)照液滴鼻,1-2h后給予PBS(劑量同白藜蘆醇)腹腔注射,連續(xù)注射5d。體積描述記法檢測(cè)各組小鼠氣道高反應(yīng)性,BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)及白細(xì)胞分類,空斑實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺組織勻漿RSV病毒滴度,H&E染色檢測(cè)小鼠肺組織病理炎癥并進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)炎癥評(píng)分。
　　 結(jié)果：白藜蘆醇干預(yù)RSV感染后小鼠,RSV+RES組小鼠肺組織勻漿RSV病毒滴度比RSV+PBS組明顯降低;BALF中細(xì)胞總數(shù)RSV感染后均較Control組明顯增多,淋巴細(xì)胞比例明

8、顯增高,巨噬細(xì)胞比例明顯減少,給予白藜蘆醇后,RSV+RES組與RSV+PBS組相比,BALF中細(xì)胞總數(shù)明顯減少,淋巴細(xì)胞比例明顯降低,巨噬細(xì)胞比例明顯增高:H&E染色病理組織炎癥,RSV感染后炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯加重,炎癥病理評(píng)分比Control組明顯增高,給予白藜蘆醇后,RSV+RES組與RSV+PBS組相比,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕,炎癥病理評(píng)分顯著降低;小鼠吸入乙酰甲膽堿濃度12.5mg/ml-50mg/ml時(shí)氣道高反應(yīng)性,RSV感染后

9、比Control組顯著升高,給予白藜蘆醇后,小鼠吸入乙酰甲膽堿濃度12.5mg/ml-50mg/ml時(shí)氣道高反應(yīng)性,RSV+RES組較RSV+PBS組明顯降低,但與Control組相比仍有所增高。
　　 結(jié)論：白藜蘆醇干預(yù)RSV感染后小鼠,能夠降低小鼠肺組織勻漿RSV病毒滴度,抑制RSV在體內(nèi)復(fù)制,減輕RSV感染誘導(dǎo)的肺部炎癥,緩解RSV感染誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性。
　　 第三部分：白藜蘆醇抑制RSV誘導(dǎo)氣道炎癥和氣道高反應(yīng)

10、性的機(jī)制探討。
　　 目的：研究IFN-γ在白藜蘆醇抑制RSV感染所致氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性中的作用,探討白藜蘆醇抑制RSV誘導(dǎo)氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的可能機(jī)制。
　　 方法：BALB/c小鼠分為Control組、RSV+PBS組、RSV+RES組,每組8只:RSV+RES組:環(huán)磷酰胺注射第5d,感染RSV,1-2h后給予白藜蘆醇30mg/kg腹腔注射,連續(xù)給藥5d。RSV+PBS組:環(huán)磷酰胺注射第5d,感染RSV,1-

11、2h后給予PBS(劑量同白藜蘆醇)腹腔注射,連續(xù)注射5d。Control組:環(huán)磷酰胺注射第5d,RSV病毒對(duì)照液滴鼻,1-2h后給予PBS(劑量同白藜蘆醇)腹腔注射,連續(xù)注射5d。ELISA法檢測(cè)BALF中炎癥因子、細(xì)胞因子表達(dá),Q-PCR檢測(cè)TLR3和M2受體的基因表達(dá),Western blot檢測(cè)TRIF蛋白表達(dá),為進(jìn)一步檢測(cè)IFN-γ在RSV誘導(dǎo)的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的作用,RSV感染后用IFN-γ單抗中和IFN-γ表達(dá),檢測(cè):

12、BALF中細(xì)胞計(jì)數(shù)及白細(xì)胞分類,體積描述記法檢測(cè)小鼠氣道高反應(yīng)性。
　　 結(jié)果：RSV感染小鼠后,BALF中IFN-γ表達(dá)較Control組顯著升高,IL-17,IL-4,IL-10,IL-12,IL-6表達(dá)均無(wú)明顯差異,給予白藜蘆醇干預(yù)后,IFN-γ表達(dá)水平RSV+RES組比RSV+PBS組明顯降低,與Control組相比無(wú)明顯變化,IL-17,IL-4,IL-10,IL-12,IL-6表達(dá)均無(wú)顯著差異;給予IFN-γ單抗后,

13、BALF中細(xì)胞總數(shù)較RSV+PBS組明顯減少,淋巴細(xì)胞比例有所降低,巨噬細(xì)胞比例有所升高;吸入乙酰甲膽堿濃度12.5mg/ml-50mg/ml時(shí),小鼠氣道高反應(yīng)性明顯降低,但RSV+anti-IFN-γ組較Control組有所升高;Q-PCR結(jié)果顯示RSV感染后小鼠肺組織TLR3表達(dá)明顯上調(diào),M2受體表達(dá)明顯下降,給予白藜蘆醇干預(yù)后,TLR3受體表達(dá)有所下調(diào),M2受體表達(dá)有所上調(diào),但是給予IFN-γ單抗后M2受體表達(dá)無(wú)明顯變化;West