經(jīng)鼻T-bet基因轉(zhuǎn)染對(duì)RSV感染小鼠氣道炎癥的影響.pdf

1、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是兒科常見(jiàn)的呼吸道病原之一,屬副黏病毒科肺炎屬,為多形、外有蛋白包裹的核內(nèi)RNA病毒,表面功能蛋白主要有兩類:F蛋白和G蛋白,其中F蛋白主要介導(dǎo)胞膜融合及傳入,引起Th1型炎癥反應(yīng)；而G蛋白主要介導(dǎo)吸附,引起Th2型炎癥反應(yīng)。目前普遍認(rèn)為RSV感染所造成的免疫異常表現(xiàn)為T(mén)h1/Th2細(xì)胞功能和比例失衡,表現(xiàn)為T(mén)h1細(xì)胞及其分泌的因子不足,Th2細(xì)胞數(shù)量增多和

2、功能亢進(jìn)。RSV感染呈全球性分布,具有顯著的季節(jié)性,多流行于冬春兩季。主要表現(xiàn)為毛細(xì)支氣管炎和肺炎,嚴(yán)重時(shí)可引起梗阻性肺氣腫,甚至可致呼吸衰竭、心力衰竭等。RSV感染還可引起哮喘等其他呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)作。
　　 T-bet,是2000年發(fā)現(xiàn)的一種Th1細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子,在Th1細(xì)胞分化中起核心作用。通過(guò)激活I(lǐng)FN-γ的基因轉(zhuǎn)錄,T-bet可誘導(dǎo)自身再表達(dá),再通過(guò)細(xì)胞因子誘導(dǎo)初始Th(Th0)細(xì)胞向Th1細(xì)胞的分化,甚至在

3、其他轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用下可將分化中的Th2和已完全分化的Th2細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為T(mén)h1細(xì)胞,伴隨大量的IFN-γ產(chǎn)生,并抑制Th2類細(xì)胞因子(IL-4、IL-5、IL-13等)的產(chǎn)生。T-bet還能直接抑制Th2細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)而抑制Th2細(xì)胞分化及促進(jìn)Th1細(xì)胞分化。
　　 研究目的:通過(guò)模擬自然感染途徑,在建立小鼠RSV感染模型的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討經(jīng)鼻T-bet基因轉(zhuǎn)染對(duì)小鼠氣道炎癥的影響。
　　 研究方法:1.建立小

4、鼠原發(fā)性RSV感染模型。健康6～8周齡SPF級(jí)Balb/c小鼠36只,按隨機(jī)數(shù)字表法分為四組。對(duì)照組:Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)上清液給Balb/c小鼠滴鼻,實(shí)驗(yàn)組:用三個(gè)不同滴度的RSVLong株給Balb/c小鼠滴鼻,每個(gè)滴度一組。分別在第3天、5天、8天無(wú)菌取出肺組織,用于病毒分離、病毒滴度測(cè)定和病理學(xué)檢查。2.健康6～8周齡SPF級(jí)Balb/c小鼠40只,按隨機(jī)數(shù)字表法分為四組:正常對(duì)照組(A組):Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)上清液滴鼻五天后,予

5、293細(xì)胞培養(yǎng)上清液滴鼻；RSV感染模型組(B組):Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)RSV液滴鼻五天后,293細(xì)胞培養(yǎng)上清液滴鼻；模型/對(duì)照病毒載體(rAAV-eGFP)干預(yù)組(C組):Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)RSV液滴鼻五天后,293細(xì)胞包裝rAAV-eGFP液滴鼻；模型/rAAV-T-bet干預(yù)組(D組),Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)出RSV液滴鼻五天后,293細(xì)胞包裝rAAV-T-bet液滴鼻；每組10只,試驗(yàn)處理在腹腔麻醉的基礎(chǔ)上進(jìn)行。第二次滴鼻7天后,每組

6、選擇6只小鼠用于肺泡灌洗,灌洗液離心后作細(xì)胞計(jì)數(shù),離心后的上清液用于測(cè)定IL-4和IFN-γ水平,另外4只用于病理學(xué)分析。
　　 結(jié)果:1.結(jié)合小鼠的表現(xiàn)、肺組織病毒分離、病毒滴度的檢測(cè)及肺組織病理學(xué)變化,共同表明成功建立了小鼠RSV感染模型。2.在建立小鼠RSV感染模型的基礎(chǔ)上,經(jīng)鼻應(yīng)用rAAV-T-bet轉(zhuǎn)染傳遞T-bet基因,通過(guò)對(duì)模型小鼠氣道內(nèi)各種可被轉(zhuǎn)染細(xì)胞免疫失衡的調(diào)控,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抑制肺內(nèi)炎癥反應(yīng)的作用:B組小鼠BAL

7、F中細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比分別為(43.91±10.41)×106/ml,(65.15±1.88)％,A組分別為(14.52±3.57)×106/ml、(25.79±1.07)％,A、B兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比分別為(24.84±4.35)×106/ml,(29.48±11.97)％,與B組和C組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組織病理切片觀察:A組小鼠氣道

8、無(wú)明顯炎癥變化,B組和C組小鼠小支氣管、血管黏膜下和周圍肺組織有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),血管壁明顯水腫；D組小鼠氣道炎癥明顯減輕。B組小鼠BALF中IL-4和IFN-γ,水平分別為(74.32±10.06)pg/ml,(89.36±20.38)pg/ml,A組小鼠分別為(6.01±1.02)pg/ml,(177.32±18.16)pg/ml,A、B兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；D組小鼠BALF中IL-4和IFN-γ水平分別為(4