雞毒支原體兩種膜相關(guān)糖酵解酶的生物學(xué)功能研究.pdf

1、雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum)是重要的禽病原體之一，主要引起雞的慢性呼吸道疾病和火雞傳染性竇炎。由于缺乏三羧酸循環(huán)途徑中的很多酶，通過糖酵解途徑獲取能量對于這類缺乏細(xì)胞壁的微生物來講就顯得尤為重要。醛縮酶(adolase，F(xiàn)BA)和丙酮酸激酶(pyruvate kinase，pykF)是糖酵解途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶之一，但它們在支原體中的功能尚不清楚，本文將開展其生物學(xué)功能的研究。
　　1.醛縮酶的生物學(xué)

2、功能研究
　　根據(jù)已發(fā)表的雞毒支原體醛縮酶基因序列，設(shè)計(jì)特異性的引物，以雞毒支原體Rlow株基因組為模板，通過Overlap PCR點(diǎn)突變擴(kuò)增雞毒支原體fba基因，將fba克隆至pET28a(+)載體后進(jìn)行序列測定和分析。結(jié)果表明，fba全長873bp，編碼290個(gè)氨基酸。將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-fba轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，在IPTG誘導(dǎo)下成功獲得表達(dá)融合蛋白rMGfba，大小約為33kDa。純化蛋白并對蛋白

3、進(jìn)行酶活性檢測，結(jié)果顯示該酶在體外具有與陽性對照醛縮酶相同的催化功能。同時(shí)用該蛋白免疫小鼠，制備多克隆抗體。提取雞毒支原體膜蛋白，Western-blot顯示FBA多抗血清可與該膜蛋白發(fā)生特異性結(jié)合;免疫膠體金電鏡結(jié)果進(jìn)一步說明了FBA位于雞毒支原體膜表面。同時(shí)表達(dá)熒光蛋白和FBA的E.coli-fba-gfp重組菌株可黏附禽DF-1細(xì)胞，且FBA多抗血清對支原體黏附宿主細(xì)胞的阻斷率達(dá)42.68％，說明了醛縮酶可介導(dǎo)支原體黏附宿主細(xì)胞，

4、這為進(jìn)一步研究該酶的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　2.丙酮酸激酶的生物學(xué)功能研究
　　為了研究丙酮酸激酶的生物學(xué)功能，我們利用pET系統(tǒng)首先原核表達(dá)了該蛋白。將PCR擴(kuò)增的pykF基因插入pET28a(+)載體構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-pykF，將鑒定為陽性的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)構(gòu)建重組菌E.coli-pykF，重組菌在IPTG誘導(dǎo)下成功獲得融合蛋白rMGpykF，表達(dá)的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后用考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果

5、顯示該蛋白大小約為60kDa，與預(yù)期結(jié)果相符。純化蛋白并對蛋白進(jìn)行酶活性檢測，結(jié)果顯示該酶具有與陽性對照丙酮酸激酶相同功能，都可催化NADH形成NAD+，說明雞毒支原體中pykF基因編碼丙酮酸激酶。用純化的蛋白免疫小鼠，制備多克隆抗體，免疫印跡反應(yīng)和免疫電鏡結(jié)果都顯示丙酮酸激酶存在于雞毒支原體膜表面。同時(shí)用雞毒支原體陽性血清孵育轉(zhuǎn)印有表達(dá)丙酮酸激酶的E.coli-pykF全菌蛋白的NC膜，結(jié)果有陽性條帶出現(xiàn)，說明丙酮酸激酶是一個(gè)免疫原性

6、蛋白;補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)顯示丙酮酸激酶血清有66.16％的殺菌效率，說明該酶對機(jī)體可產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)力。為了進(jìn)一步探明作為膜蛋白的丙酮酸激酶的功能，構(gòu)建了同時(shí)表達(dá)熒光蛋白和丙酮酸激酶的重組菌株E.coli-pykF-gfp，利用細(xì)菌感染DF-1細(xì)胞來體外模擬支原體感染細(xì)胞，結(jié)果顯示只有表達(dá)丙酮酸激酶的陽性重組菌才能黏附DF-1細(xì)胞，且丙酮酸激酶多抗血清具有明顯的阻斷支原體黏附宿主細(xì)胞的作用，阻斷率達(dá)39.13％，說明作為膜蛋白的丙酮