抗體的磁性微球制備和膠體金標記技術的應用研究.pdf

1、免疫磁性微球定向富集稀樣本中的靶物質(zhì)具有特異性強、高效快速等優(yōu)點。本課題首先用牛乳源蛋白β-CN免疫大白兔制備得到抗血清，經(jīng)鹽析和層析純化后得到兔抗β-CNIgG;對反相懸浮乳液包埋法制備磁性微球的條件進行了優(yōu)化，對制備得到的微球進行醛基化和嗜硫修飾，并同未修飾微球一起進行了抗體吸附和抗原富集的性能比較，確定最優(yōu)修飾方法;用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，標記鹽析IgG后用于金標墊的包被，檢測墊經(jīng)層析IgG和二抗包被后組裝各部件得到β-CN

2、膠體金免疫層析試紙條，對其靈敏性、特異性及穩(wěn)定性進行測試，并用其對三種免疫磁性微球的抗原富集液進行定性檢測。
　　 特異性多克隆抗體的制備。選取牛乳源蛋白β-CN做為抗原免疫大白兔，頸動脈取血后得到的抗血清用飽和硫酸銨分級鹽析法(50％、40％、33％)粗分離抗體，用蛋白A親和色譜柱對粗分離的抗體進行層析純化。考馬斯亮藍法測定鹽析和層析樣品的蛋白含量分別為2.42μg/ml和1.06μg/ml，其中層析樣品經(jīng)SDS-PAGE檢測

3、分析得抗體純度達到95％以上，用間接ELISA法測定兩者效價均為1∶8000。
　　 殼聚糖/明膠磁性微球的制備。采用反相懸浮乳液包埋法制備磁性微球并進行優(yōu)化試驗，確定最佳方案為:水相為3％殼聚糖-2％明膠-1％磁性粒子;油相液體石蠟/乳化劑span-80為1∶0.03;水油比為1∶4;最佳乳化時間8-10min;最佳轉速575r/min;固化交聯(lián)劑25％戊二醛加入量為0.5ml/5ml水相樣品;磁性微球洗滌順序為石油醚、丙酮:

4、水3∶1、異丙醇。得到的磁性微球經(jīng)SEM拍照觀察粒徑在3-8μm范圍內(nèi)，磁響應性良好。
　　 磁性微球修飾及性能比較。對微球進行醛基化和嗜硫修飾，同未修飾微球一起進行磁響應性、BSA吸附效果、抗體吸附量、抗體吸附穩(wěn)定性及抗原富集效果的比較，其中醛基化磁性微球各項性能均優(yōu)于其它兩種，每1g醛基化微球的IgG吸附量為118.5μg/ml，經(jīng)抗原解析劑作用后抗體保留率為94.47％，用醛基化免疫磁性微球富集抗原β-CN后，其富集液中抗

5、原純度較高，抗原富集倍數(shù)為3.19。
　　 免疫膠體金制備。采用檸檬酸三鈉還原法制備穩(wěn)定無沉淀的膠體金溶液，用鹽析兔抗β-CNIgG對其進行標記，確定最佳標記量為鹽析兔抗β-CNIgG（242μg/ml）26μl/ml膠體金，最佳標記pH是8.0，制備免疫膠體金溶液并進行純化，間接ELISA測定其效價為1∶800。
　　 β-CN膠體金免疫層析試紙條制備。通過優(yōu)化試驗確定試紙條各部分處理如下，金標墊（玻璃纖維素膜）用PB

6、S1∶1稀釋的免疫膠體金包被;硝酸纖維素膜上T線用400μg/ml兔抗β-CNIgG畫線包被6次共3μl，C線用200μg/ml羊抗兔IgG畫線包被3次共1.5μl，各部件準備好后組裝試紙條。β-CN膠體金免疫層析試紙條對β-CN標準溶液和脫脂牛乳檢出線均為31.25μg/ml。用試紙條對未修飾、醛基化、嗜硫化免疫磁性微球的β-CN富集液進行定性檢測，結果分別為弱陽性、強陽性和弱陽性，表明富集過程對抗原的反應原性未產(chǎn)生影響，并且制備的試