大鼠丘腦前核參與學(xué)習(xí)記憶的分子生物學(xué)研究.pdf

1、目的:學(xué)習(xí)記憶是人類和動(dòng)物生存不可缺少的重要功能。學(xué)習(xí)(learning)是獲得新信息和新知識(shí)的神經(jīng)過(guò)程,而記憶(memory)則是對(duì)所獲取信息的編碼、鞏固、保存和讀出的神經(jīng)過(guò)程。大腦具有多重記憶系統(tǒng),如記憶可分為陳述性記憶(declarative memory)和非陳述性記憶(non-declarative memory)等,不同類型的記憶在不同的腦區(qū)中貯存,海馬、丘腦、杏仁核、前額葉皮層及基底神經(jīng)節(jié)等都與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)

2、丘腦前核在空間學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮重要作用。
　　 1973年Bliss和lomo首次在兔海馬觀察到突觸傳遞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(Long term potentiation LTP)現(xiàn)象,長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)很可能是學(xué)習(xí)與記憶的神經(jīng)生理基礎(chǔ),而長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)現(xiàn)象的發(fā)生及維持過(guò)程與突觸前膜釋放谷氨酸的增加有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)膠體金免疫電鏡等技術(shù)發(fā)現(xiàn)丘腦前核與邊緣皮質(zhì)學(xué)習(xí)記憶環(huán)路間存在的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)是谷氨酸,但丘腦前核內(nèi)是否存在NMDA受體研究較少。

3、r>　　 越來(lái)越多的研究證實(shí),MAPK/ERK信號(hào)通路與腦內(nèi)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的形成以及學(xué)習(xí)記憶功能有重要的聯(lián)系。如經(jīng)水迷宮訓(xùn)練后的大鼠,海馬CA1/CA1區(qū)ERK被激活,使用PD098059抑制MAPK/ERK級(jí)聯(lián)反應(yīng)則p-ERK蛋白含量降低,并且長(zhǎng)期空間記憶的形成受損。丘腦前核在學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中,ERK通路是否參與胞內(nèi)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)目前仍不清楚。
　　 即早基因(Immediate early genes IEGs)被認(rèn)為是核內(nèi)的第三信

4、使,如大鼠海馬內(nèi)注射c-Fos的反義寡核苷酸后發(fā)現(xiàn)大鼠的長(zhǎng)時(shí)記憶鞏固過(guò)程障礙。丘腦前核在空間學(xué)習(xí)記憶即早基因是否參與仍不清楚。
　　 突觸可塑性包括兩個(gè)方面,長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(Long-term potentiation LTP)和長(zhǎng)時(shí)程抑制(Long-term depression LTD),LTP和LTD對(duì)一個(gè)完整的學(xué)習(xí)記憶神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)均不可缺少,LTD在學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮著不斷糾正錯(cuò)誤的作用。γ-氨基丁酸(γ-Amino butyric

5、 acid,GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),GABA與LTD有關(guān)。目前丘腦前核內(nèi)GABA及其受體的表達(dá)仍不明確。
　　 本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖窃谇捌诎l(fā)現(xiàn)丘腦前核內(nèi)存在谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)基礎(chǔ)上,探討丘腦前核內(nèi)NMDA受體表達(dá),Morris水迷宮訓(xùn)練后ERK1/2的變化以及c-Fos和c-Jun的表達(dá)。并探討抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABAA受體在丘腦前核的表達(dá)。
　　 方法：
　　 1.通過(guò)原位雜交觀察大鼠丘腦前核內(nèi)NR1

6、,NR2A及NR2BmRNA的表達(dá)及分布特點(diǎn)。
　　 2.成年雄性SD大鼠31只,分為3組:PD組:側(cè)腦室內(nèi)注射5ul PD098059溶液(PD0980593ug/只);PD對(duì)照組:側(cè)腦室內(nèi)注射5ul DMSO溶劑;正常組:未進(jìn)行側(cè)腦室注射。在Morris水迷宮中,定位航行訓(xùn)練后,行側(cè)腦室內(nèi)注射,24小時(shí)后空間探索實(shí)驗(yàn)。免疫組化檢測(cè)p-ERK的變化。
　　 3.成年雄性SD大鼠分為3組,正常組:未經(jīng)Morris水迷宮訓(xùn)

7、練;訓(xùn)練組:通過(guò)Morris水迷宮訓(xùn)練:假訓(xùn)練組:撤掉平臺(tái),每天游泳次數(shù)和游泳時(shí)間與訓(xùn)練組相同。訓(xùn)練后一半免疫組化檢測(cè)c-Fos和c-Jun的表達(dá)。另一部分行Western-Blot檢測(cè)c-Fos和c-Jun蛋白的表達(dá)。
　　 4.原位雜交觀察丘腦前核內(nèi)GABAAR-alpha1和GABAAR-beta2受體mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.NR2A,NR2B及NR1mRNA在丘腦前核都有表達(dá),陽(yáng)性神經(jīng)元

8、分布較密集,細(xì)胞形態(tài)較一致,整體分布尚均勻。NR2AmRNA及NR2BmRNA在丘腦前背側(cè)核和腹側(cè)核的分布前者稍顯密集,胞體略大。同時(shí)在海馬CA1,CA3及DG和扣帶后回也觀察到NR2A,NR2B及NR1 mRNA的表達(dá)?？瞻讓?duì)照切片為陰性。
　　 2.在空間探索實(shí)驗(yàn)中PD組尋找平臺(tái)次數(shù)與對(duì)照組及正常對(duì)照組相比明顯減少(P＜0.01)。PD組在靶象限停留時(shí)間與對(duì)照組及正常組相比明顯減少(P＜0.01)。正常組在靶象限停留時(shí)間和穿

9、越平臺(tái)次數(shù)與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異,p＞0.05。
　　 p-ERK陽(yáng)性表達(dá)神經(jīng)元呈棕黃色,為圓形或橢圓形,PD對(duì)照組與PD組與正常對(duì)照組比較,在丘腦前核p-ERK組表達(dá)明顯增強(qiáng),光密度分析有顯著性差異(P＜0.01),PD組與正常對(duì)照組比較,在丘腦前核p-ERK無(wú)顯著差別。在PD對(duì)照組,丘腦前背側(cè)核(AD)的p-ERK免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物與丘腦前腹側(cè)核(AV)相比,表達(dá)顯著增強(qiáng),光密度分析有顯著性差異(P＜0.05)?？瞻讓?duì)照切片

10、為陰性,未見p-ERK表達(dá)陽(yáng)性神經(jīng)元。
　　 3.c-Fos免疫組化陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞核內(nèi),呈褐色的圓形或橢圓形。訓(xùn)練組c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞在AD和AV均有表達(dá),但AD與AV相比表達(dá)顯著增強(qiáng),經(jīng)圖像平均光密度有顯著差異(P＜0.05)。訓(xùn)練組丘腦前核c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)與正常對(duì)照組和假訓(xùn)練組比較明顯增強(qiáng),經(jīng)圖像平均光密度分析明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。C-Jun免疫組化陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞核內(nèi),呈褐色的圓形或橢圓形。訓(xùn)練組c-Jun陽(yáng)性

11、細(xì)胞在AD和AV均有表達(dá),AD與AV相比染色略強(qiáng),細(xì)胞稍顯密集,形態(tài)略大。正常對(duì)照組和假訓(xùn)練組AD和AV的c-Jun陽(yáng)性細(xì)胞都有弱的表達(dá);但訓(xùn)練組與正常對(duì)照組和假訓(xùn)練組比較染色明顯增強(qiáng),經(jīng)圖像分析平均光密度明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。
　　 4.原位雜交:GABAAR-alpha1和GABAAR-beta2 mRNA原位雜交陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物為棕黃色,主要分布在神經(jīng)元胞漿中。在AD和AV,陽(yáng)性神經(jīng)元分布較密集,細(xì)胞形態(tài)較一致,在AD和A

12、V的分布前者稍顯密集。同時(shí)大腦其他學(xué)習(xí)記憶腦區(qū)如海馬CA1,CA3及DG和扣帶后回也觀察到GABAAR-alpha1和GABAAR-beta2mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1.大鼠丘腦前核內(nèi)存在NR1、NR2A、NR2BmRNA的表達(dá)。提示丘腦前核在空間學(xué)習(xí)記憶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中細(xì)胞膜受體可能以NR1-NR2A,NR1-NR2B或NR1-NR2A-NR2B形式存在。
　　 2.大鼠通過(guò)Morris水迷宮訓(xùn)練及應(yīng)用

13、PD098059后,大鼠空間參考記憶受損,p-ERK表達(dá)減弱,提示丘腦前核空間參考記憶細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可能與MAPK途經(jīng)有關(guān)。在PD對(duì)照組,Morris水迷宮訓(xùn)練后p-ERK在丘腦前背側(cè)核表達(dá)較丘腦前腹側(cè)核表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.001)。
　　 3.Morris水迷宮訓(xùn)練后大鼠丘腦前核內(nèi)c-Fos和c-Jun蛋白表達(dá)顯著增加,提示核內(nèi)第三信使可能以Fos-Jun異源二聚體的形式,作用于靶基因AP1結(jié)合位點(diǎn),啟動(dòng)靶基因進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄。水