重組桿狀病毒介導(dǎo)甲型H1N1流感基因工程疫苗研究.pdf

1、流感是一種急性的經(jīng)呼吸道傳染的疾病，無論是對(duì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)還是人類健康均造成嚴(yán)重的危害。2009年4月，墨西哥、美國等國家相繼爆發(fā)了豬源甲型H1N1流感的疫情，之后迅速蔓延至全球范圍內(nèi)的許多國家和地區(qū)。同年6月，世界衛(wèi)生組織將此次流感流行的預(yù)警級(jí)別提升至6級(jí)。針對(duì)如此大的疫情，疫苗接種是預(yù)防和控制流感流行最有效的方法，流感病毒滅活疫苗是目前用于預(yù)防流感最為廣泛的疫苗。盡管滅活疫苗保護(hù)率較好，但仍存在著不足，如制備周期較長(zhǎng)、需要大量雞胚，另外

2、少數(shù)個(gè)體在疫苗接種后會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)。因此，科研工作者一直在試圖研制一種更安全、更高效的流感疫苗。
　　 桿狀病毒一直被用于在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)外源蛋白。最近的研究報(bào)道，表明桿狀病毒載體在真核生物啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下可以轉(zhuǎn)導(dǎo)不同類型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞并表達(dá)外源基因，同樣基因在不同啟動(dòng)子的控制下，其表達(dá)水平也會(huì)有很大的差異，且經(jīng)水泡性口膜炎病毒G蛋白(VSV/G)修飾的桿狀病毒，其宿主范圍更廣，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率更高。
　　 鑒于

3、此，本研究對(duì)甲型H1N1流感基因工程疫苗進(jìn)行新的探索，構(gòu)建了兩種啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)甲型H1N1流感免疫原性蛋白表達(dá)的重組桿狀病毒疫苗，并在小鼠模型上對(duì)所構(gòu)建的疫苗進(jìn)行免疫效力評(píng)價(jià)，主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 1、重組桿狀病毒BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/M1/NA的構(gòu)建
　　 利用對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(white spot syndrome virus，WSSV)的ie1啟動(dòng)子和人巨細(xì)胞病毒的CMV啟動(dòng)子分別構(gòu)

4、建了囊膜表面展示有VSV-G蛋白重組桿狀病毒，兩種啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的重組桿狀病毒都介導(dǎo)甲型H1N1流感新型基因工程疫苗BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/M1/NA。
　　 2、多克隆抗體的制備和重組桿狀病毒BV-CMV-HA/M1/NA、BV-ie1-HA/M1/NA的體外表達(dá)分析
　　 在HA序列的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增HA的亞基(tHA1)，用基因工程方法，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-tHA1，將原核表達(dá)

5、質(zhì)粒pET28a-tHA1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞，通過IPTG誘導(dǎo)獲得了以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白。將重組蛋白tHA1進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將目的蛋白從蛋白膠上割下，稱量，用研缽研磨至糊狀后在小鼠背部多點(diǎn)皮下注射，注射劑量為200uL。間隔兩周，再次同上方法注射，后每周加強(qiáng)免疫一次，并每周采血檢測(cè)抗體，至抗體符合要求時(shí)，即對(duì)小鼠進(jìn)行眼眶采血大量收集血清，即為鼠源多克隆抗體。
　　 為證實(shí)重組桿狀病毒在體內(nèi)能否有效

6、表達(dá)外源蛋白，將重組桿狀病毒BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/Ml/NA轉(zhuǎn)導(dǎo)BHK-21細(xì)胞，IFA試驗(yàn)表明，重組桿狀病毒BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/M1/NA均能夠在體外表達(dá)外源蛋白。
　　 3、重組桿狀病毒BV-CMV-HA/M1/NA和BV-ie1-HA/M1/NA在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫原性評(píng)價(jià)
　　 為探討重組桿狀病毒疫苗的免疫效果，以1×109PFU/只的劑量免疫BLAB

7、/c小鼠，同時(shí)用甲型H1N1流感病毒滅活疫苗做對(duì)照。結(jié)果表明：在細(xì)胞免疫方面，兩種重組桿狀病毒均產(chǎn)生了較好的體液免疫水平，另外滅活疫苗也產(chǎn)生了較好的體液免疫水平。在細(xì)胞免疫方面，檢測(cè)了IFNγ的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組桿狀病毒疫苗誘導(dǎo)了較好的細(xì)胞免疫，滅活疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫水平相對(duì)于重組桿狀病毒疫苗組則較低。
　　 4、鼠肺適應(yīng)甲型H1N1流感病毒株的制備和重組桿狀病毒BV-CMV-HA/M1/NA、BV-ie1-