小諾霉素高產(chǎn)菌株的飛秒激光選育與發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、小諾霉素是日本協(xié)和發(fā)酵公司奈良高從神奈川縣相模原市的土壤中分離得到的一株小單孢菌(M.sagamiensis var nor.reducaus)產(chǎn)生的氨基糖苷類(lèi)抗生素,具有抗菌譜廣、殺菌力強(qiáng)、耐藥性小及安全性大等特點(diǎn)。內(nèi)臟及周?chē)M織分布性好,耳、腎毒性低。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)故對(duì)6’-N乙?；窤AC(6’)的耐藥菌有抗菌效力(慶大霉素、卡那霉素及丁胺卡那霉素等對(duì)此酶易產(chǎn)生耐藥性),其療效明顯優(yōu)于慶大霉素,是一種較好地替代原有抗生素的新型氨基糖苷

2、類(lèi)抗生素。
　　小諾霉素的生產(chǎn)菌株為相模灣小單孢菌,屬于放線菌,目前還沒(méi)有建立起適合小單孢菌能夠高效表達(dá)外源基因的質(zhì)粒載體及受體系統(tǒng),存在著遺傳重組率低、產(chǎn)物合成基因簇多樣性等不利因素,致使運(yùn)用基因工程的手段改造小單孢菌受到了限制。因此,運(yùn)用合適的誘變手段,選育高產(chǎn)菌株,對(duì)菌株特性及發(fā)酵行為進(jìn)行相關(guān)表型學(xué)研究,具有重要科學(xué)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
　　1.本論文首次利用型號(hào)為Mira900,中心波長(zhǎng)810nm、頻率76MHz、脈沖時(shí)

3、間150fs的鈦寶石激光系統(tǒng),研究了飛秒激光輻照對(duì)相模灣小單孢菌的致死率以及小諾霉素合成的影響。在75mW、180s的條件下獲得了最大的正突變率17.8％。利用最佳的飛秒激光誘變條件(75mW、180s),通過(guò)高通量篩選方法,選育出一株高產(chǎn)小諾霉素并且遺傳穩(wěn)定的正突變菌株MX3004,發(fā)酵168h時(shí)后其產(chǎn)量達(dá)到126mg/L,比原始菌株(35.9mg/L)提高了2.51倍。
　　2.通過(guò)外源添加物和金屬無(wú)機(jī)鹽的添加優(yōu)化,獲得了優(yōu)化

4、發(fā)酵培養(yǎng)基,淀粉10g/L,黃豆餅粉5g/L,K2HPO41.2g/L,CaCO34g/L,CoCl20.001g/L,MgSO40.01g/L,FeSO40.015g/L,D-木糖0.05g/L。在此培養(yǎng)基下應(yīng)用7.5LNBS發(fā)酵罐發(fā)酵,突變菌株MX3004產(chǎn)量達(dá)到了263mg/L,比優(yōu)化前的產(chǎn)量137mg/L提高了91.9%。
　　3.通過(guò)對(duì)基因簇編碼的蛋白基因進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)突變菌株MX3004在一基因位點(diǎn)發(fā)生突變,一共四個(gè)堿

5、基發(fā)生改變,其中492位突變?yōu)橥x突變,其余三個(gè)堿基位點(diǎn)所編碼的氨基酸分別變?yōu)門(mén)hr84Ser、Ser121Thr、His176Asp。說(shuō)明了原始菌株經(jīng)過(guò)飛秒激光輻照后,其DNA序列發(fā)生了改變,改變后的DNA序列導(dǎo)致了其編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列的改變,這三個(gè)堿基的變化,有可能改變了蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)域,對(duì)突變菌株MX3004小諾霉素的合成有促進(jìn)作用。
　　4.對(duì)突變菌株MX3004和原始菌株進(jìn)行了發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究,通過(guò)對(duì)發(fā)酵特性分析,分