基于DNA條形碼的分子生物學(xué)方法鑒定海參種類(lèi)的研究.pdf

1、海參是我國(guó)傳統(tǒng)的海洋食物和藥物資源。近年來(lái)，隨著對(duì)海參研究的不斷深入，國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)海參具有提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、促進(jìn)造血功能、抗凝血和降血脂等多種生理功效，海參及海參產(chǎn)品也因此得到越來(lái)越多的關(guān)注。海參膠囊、即食海參、海參口服液等產(chǎn)品的出現(xiàn)，豐富了海參產(chǎn)品的種類(lèi)，進(jìn)一步提升了海參的價(jià)值。傳統(tǒng)的海參鑒定方法主要依據(jù)海參的外部形態(tài)和解剖特征，但這種方法不適用于加工后的海參的種類(lèi)鑒定。因此建立快速、簡(jiǎn)便的海參種類(lèi)鑒定方法，對(duì)于規(guī)范海參市場(chǎng)、

2、保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益至關(guān)重要，對(duì)加快海參產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展具有重要的意義。
　　 隨著DNA條形碼概念的提出，基于DNA條形碼的分子生物學(xué)技術(shù)取得了快速發(fā)展，在種類(lèi)鑒定領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。本論文研究了海參線(xiàn)粒體細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ(Mitochondrial cytochrome c oxidase subunitⅠ，COⅠ)基因作為DNA條形碼用于海參種類(lèi)鑒定的可行性。利用DNAstar6.1、DNAMAN6.0和MEGA4.1軟

3、件對(duì)海參線(xiàn)粒體COⅠ基因序列進(jìn)行分析，計(jì)算不同海參的堿基組成，海參的種間遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離，分別利用鄰接法和最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建了分子系統(tǒng)樹(shù)。結(jié)果表明：海參的種間遺傳距離顯著大于種內(nèi)遺傳距離，同種海參不同個(gè)體在系統(tǒng)樹(shù)中分別形成各自獨(dú)立的分支，表明以COⅠ基因作為海參DNA條形碼進(jìn)行種類(lèi)鑒定具有一定的可行性。
　　 在DNA條形碼的基礎(chǔ)上，建立了斑點(diǎn)雜交方法用于四種常見(jiàn)經(jīng)濟(jì)海參種類(lèi)的鑒定。首先利用DNAStar6.1對(duì)加州擬刺參(P

4、arastichopus californicus)，北大西洋瓜參(Cucumaria frondosa)，仿刺參(Apostichopus japonicas)及梅花參(Thelenota ananas)四種海參的線(xiàn)粒體COⅠ基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，然后采用Primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)四種海參的特異性探針，用于斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的四條探針具有高度的特異性，靈敏度可達(dá)100ng，能夠?qū)崿F(xiàn)四種海參的準(zhǔn)確鑒定。<

5、br>　　 根據(jù)對(duì)四種海參線(xiàn)粒體COⅠ基因的比對(duì)結(jié)果，采用Primer premier5.0設(shè)計(jì)合成了四組特異性引物，建立了多重PCR方法用于四種海參種類(lèi)的鑒定。仿刺參、梅花參、加州擬刺參和北大西洋瓜參的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為212bp、301bp、261bp和358bp，能夠通過(guò)電泳得到區(qū)分。對(duì)多重PCR的特異性和靈敏度進(jìn)行研究，結(jié)果表明，四組引物具有高度的特異性，靈敏度達(dá)到ng級(jí)；對(duì)不同海參的混合樣品進(jìn)行多重PCR鑒定，結(jié)果顯示該方法

6、能夠同時(shí)檢測(cè)混合樣品中的所有海參種類(lèi)。表明多重PCR方法是一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好的海參種類(lèi)鑒定方法。
　　 采用DNAMAN6.0對(duì)加州擬刺參(Parastichopus californicus)，北大西洋瓜參(Cucumaria frondosa)，仿刺參(Apostichopus japonicas)，梅花參(Thelenotaananas)及輻肛參(Actinopyga lecanora)線(xiàn)粒體COⅠ基因進(jìn)行分

7、析，建立酶切圖譜，選擇BamHⅠ，KpnⅠ，PstⅠ，XbaⅠ，Eco31Ⅰ用于五種海參的PCR-RFLP的分析。采用限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)五種海參線(xiàn)粒體COⅠ基因進(jìn)行酶切，酶切結(jié)果與分析結(jié)果吻合，沒(méi)有非特異性酶切條帶的出現(xiàn)。對(duì)不同海參的混合樣品進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明，本研究建立的PCR-RFLP方法能同時(shí)鑒定兩種海參。說(shuō)明建立的PCR-RFLP是一種簡(jiǎn)單、快速、可靠的海參種類(lèi)鑒定方法。
　　 分別采用斑點(diǎn)雜交、多重PCR、PCR-RFL