基于DNA酶和氧化石墨烯的高靈敏熒光生物傳感體系的研究.pdf

1、生物傳感器(Biosensor)是由生物學(xué)、物理學(xué)、數(shù)學(xué)、化學(xué)、計算機科學(xué)等多個學(xué)科交叉融合而發(fā)展起來的一門新興而活躍的學(xué)科。近年來新的分子生物學(xué)技術(shù)不斷涌現(xiàn)，并在科學(xué)研究和實際應(yīng)用中得到不斷的發(fā)展和完善，使生物分子檢測的靈敏度和特異性都得到很大的提高。然而隨著疾病診斷要求的不斷提高與科學(xué)研究的不斷深入，我們迫切需要發(fā)展一些靈敏度高、選擇性好、操作簡單且成本低廉的生物傳感器以便更好地滿足科學(xué)研究和實際應(yīng)用的需求。目前提高熒光傳感器靈敏度

2、的方法主要有兩類:一類是通過使用碳納米材料等超級猝滅劑提高猝滅效率以降低檢測熒光背景，另一類則是利用各種酶切催化循環(huán)放大手段提高傳感器的靈敏度。
　　 基于以上考慮，綜合文獻報道，本文主要采用可降低背景信號的熒光猝滅劑以及信號放大技術(shù)在提高生物傳感器的靈敏度方面做了一些工作，主要內(nèi)容如下:
　　 (1)基于DNA酶生物傳感體系的研究。DNA酶是利用體外篩選的組合生物學(xué)技術(shù)獲得的一段具有催化功能的DNA片段。在第2章中，我

3、們基于氧化石墨烯(GO)對不同長度的單鏈DNA具有不同的吸附力設(shè)計了一種熒光增強型的DNA酶生物傳感器用于鉛離子的檢測。由于底物鏈和酶鏈的雜交探針中含有一段單鏈DNA序列，故該探針可以吸附在氧化石墨烯上，并使底物鏈5'端的熒光基團靠近GO，從而導(dǎo)致熒光團的熒光被猝滅。當加入pb2+后，DNA酶的催化活性被激活，并將底物鏈切割為兩部分。含有熒光團的短鏈DNA（5個堿基）從酶鏈上解鏈游離下來。釋放出的酶鏈可繼續(xù)與未反應(yīng)的底物鏈雜交，同時誘發(fā)

4、下一輪的催化切割，如此循環(huán)，傳感體系中就存在很多標記有熒光團的短鏈DNA。加入GO之后，由于短鏈DNA與氧化石墨烯結(jié)合力很弱，故熒光團遠離氧化石墨烯而使其熒光不被猝滅。該傳感器的靈敏度很高，對鉛離子的檢測限為300pM。
　　 上一章報道的DNA酶熒光傳感器對酶鏈有一定的要求，即酶鏈的環(huán)狀部分需要有一段長的DNA單鏈便于雜交探針吸附在GO上。如果環(huán)狀部分的單鏈DNA太短或以雙鏈形式存在就會影響雜交探針與GO的結(jié)合能力，從而導(dǎo)致傳

5、感器的背景熒光增加。因此，利用GO做熒光猝滅劑限制了上述傳感器的通用性。在第3章中，我們利用苝二酰亞胺陽離子化合物的團聚體作猝滅劑構(gòu)建了一個通用的DNA酶生物傳感平臺。苝二酰亞胺陽離子化合物可以吸附于DNA酶探針上并發(fā)生團聚，而其團聚體可以通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移猝滅熒光團(FAM)的熒光。鉛離子或L-組氨酸的加入使DNA酶的催化活性被激活并將底物鏈切割為兩部分，釋放出標記有FAM的短鏈DNA、另外一段底物鏈以及DNA酶。被釋放的DNA酶可

6、繼續(xù)同未反應(yīng)的底物鏈雜交，同時誘發(fā)下一輪的催化切割。由于苝二酰亞胺陽離子化合物主要吸附在酶鏈和切割后的另外一段底物鏈上，而標記有FAM的短鏈DNA只有5個堿基，苝二酰亞胺陽離子化合物很難與其結(jié)合，因此FAM的熒光未被猝滅。該傳感器具有很高的靈敏度和選擇性且通用性好，可用于檢測各種目標物。
　　 催化信標是當目標物存在時可以催化DNA酶水解底物鏈從而產(chǎn)生熒光信號增強的熒光檢測體系。一般來說，催化信標由標記熒光團的底物鏈和標記猝滅團

7、的DNA酶鏈組成，其中底物鏈與DNA酶鏈的比例應(yīng)嚴格控制在≤1，而這樣限制了催化信標在信號放大檢測中的應(yīng)用。另外，這種催化信標熒光猝滅效率較低，因此具有較高的熒光背景。在第4章中，基于具有特殊莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的分子信標和與之具有相同配對堿基的雙鏈DNA之間熔鏈溫度的差異，我們提出了一種利用分子信標作為底物鏈，從而避免對DNA酶修飾且能進行多重循環(huán)信號放大的新型熒光催化信標。而且該新型催化信標還可作為熒光放大基團用手目標DNA的檢測。其動力學(xué)響

8、應(yīng)范圍為0.5 nM～300 nM，檢測下限為200 pM。
　　 為了進一步拓寬DNA酶的應(yīng)用范圍，在第5章中，我們基于DNA酶拓撲結(jié)構(gòu)的改變可引起其催化活性的改變構(gòu)建了一個通用的放大傳感平臺用于檢測DNA序列和酶的活性。由于8-17 DNAzyme的部分序列被固定于探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)中，故酶的催化活性被抑制。當存在目標物（DNA或甲基化酶）時，目標物和探針作用使其發(fā)夾結(jié)構(gòu)被打開，8-17 DNA酶從發(fā)夾結(jié)構(gòu)中釋放出來且催化活性被

9、激活。具有催化活性的8-17 DNA酶可與發(fā)夾型的分子信標底物雜交形成催化分子信標傳感體系。加入鋅離子后，DNA酶催化切割分子信標底物，使底物鏈片段從酶鏈上游離下來，熒光明顯增強。最后游離出來的8-17 DNA酶的酶鏈可重新與分子信標底物雜交，引發(fā)下一輪的催化切割，如此循環(huán)，實現(xiàn)了目標物的放大檢測。此外，我們還利用小分子末端保護策略和DNA酶的信號放大功能實現(xiàn)了蛋白質(zhì)的放大檢測。當不存在鏈霉親和素(SA)時，DNA探針被核酸外切酶Ⅰ(E

10、xoⅠ)切割為單堿基核苷酸，故不能催化切割分子信標底物，因此傳感器的背景熒光很低。當存在SA時，探針上標記的生物素和SA結(jié)合從而阻止了ExoI切割DNA探針。最后包含8-17 DNA酶序列的DNA探針可以催化切割分子信標底物并引起傳感體系熒光信號的增強。
　　 (2)在第6章中，我們將氧化石墨烯高的熒光猝滅率與核酸外切酶Ⅲ信號放大功能結(jié)合構(gòu)建了一種高靈敏、快速、單標記的DNA熒光傳感器。標記有熒光素(FAM)的DNA探針以單鏈形

11、式存在故不能被核酸外切酶Ⅲ切割，因此它可以通過π-π堆積作用吸附于GO表面并且熒光被猝滅。當目標DNA和探針鏈雜交后，核酸外切酶Ⅲ沿3'→5'方向?qū)⑻结樻溓懈畛蓧A基碎片，從而目標DNA被釋放出來。釋放出的目標DNA可繼續(xù)和其它DNA探針雜交同時誘發(fā)第二次酶切循環(huán)反應(yīng)。當酶切反應(yīng)結(jié)束后加入適量的GO，由于DNA探針被切碎，故FAM遠離GO而使其熒光不被猝滅。實驗結(jié)果表明該方法可實現(xiàn)對目標DNA的高靈敏檢測，檢測下限為20 pM。
　

12、　 (3)在第7章中，我們利用苝二酰亞胺陽離子化合物作為熒光信號的報告分子，富G核苷酸序列作為鉛離子的識別探針構(gòu)建了一種簡單、快速和無標記的熒光增強型鉛離子傳感器。帶正電荷的苝二酰亞胺陽離子化合物和帶負電荷的DNA探針之間強的靜電吸附作用導(dǎo)致苝二酰亞胺陽離子化合物吸附在DNA探針上并使其熒光被猝滅。當加入鉛離子后，DNA探針從單鏈狀態(tài)折疊成穩(wěn)定的G四股螺旋結(jié)構(gòu)。此時，花二酰亞胺陽離子化合物與G四股螺旋結(jié)構(gòu)的吸附力遠低于它與單鏈DNA的