基于分子生物學(xué)的肉類鑒定方法研究.pdf

1、本文建立了五種常見肉類、四種犬科動(dòng)物和驢肉中摻雜牛肉的PCR方法;牛、羊肉的真實(shí)性鑒定的PCR-RFLP和TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。
　　 1、分別使用設(shè)計(jì)的牛、羊、豬、雞和鴨的特異性引物對(duì)，對(duì)牛、羊、豬、雞和鴨肉的總DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了大小為494、716、611、259和350bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，又加以限制性酶切反應(yīng)，證實(shí)了PCR擴(kuò)增的特異性;運(yùn)用這五對(duì)引物，檢測了摻雜牛、豬、雞和鴨肉的羊肉，結(jié)果顯示，該方

2、法的檢出限可以達(dá)到1％以下;進(jìn)而建立了運(yùn)用PCR技術(shù)準(zhǔn)確、有效地鑒別五種常見動(dòng)物肉類成分的方法。
　　 2、分別使用設(shè)計(jì)的狐貍、貉子、水貂和家犬的特異性引物對(duì)，對(duì)狐貍、貉子、水貂和家犬的總DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了大小為701、840、382和473bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，又加以限制性酶切反應(yīng)，證實(shí)了PCR擴(kuò)增的特異性。進(jìn)而建立了運(yùn)用PCR技術(shù)準(zhǔn)確、有效地鑒別四種犬科動(dòng)物的方法。
　　 3、通過設(shè)計(jì)特異性引物將目的片段DN

3、A進(jìn)行擴(kuò)增，建立鑒別驢肉中摻假牛肉PCR鑒別方法。分別用牛和驢的特異性引物對(duì)，對(duì)牛、驢的總DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了大小為494bp和261bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，又加以限制性酶切反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了牛的PCR擴(kuò)增的特異性。結(jié)果表明，該方法可以準(zhǔn)確、有效地鑒別出驢肉和牛肉。
　　 4、通過一對(duì)通用引物對(duì)樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增后，經(jīng)AluI酶切，建立了牛羊肉的PCR-RFLP快速鑒別方法。以五種純?nèi)鈽悠返目侱NA作為模板，均用通用引物對(duì)，

4、進(jìn)行了PCR反應(yīng)，均能擴(kuò)增出長度為435-445bp的片段;各PCR產(chǎn)物經(jīng)AluI進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物都符合軟件設(shè)計(jì)。結(jié)果表明，該方法可以有效從五種常見肉種中鑒別出牛、羊肉。為了研究方法對(duì)摻假牛羊肉的適用性，制成了摻雜不同比例豬肉的牛、羊肉樣品，并提取了這些樣品的總DNA，然后均用通用引物對(duì)擴(kuò)增、AluI酶切，結(jié)果對(duì)于摻雜牛、羊肉樣品，都只有當(dāng)豬肉摻雜比例≥30％時(shí)才有明顯的酶切條帶，僅能在一定范圍內(nèi)適用，對(duì)于市場上相當(dāng)一部分摻假牛羊肉不

5、適用。本研究建立的PCR-RFLP方法對(duì)于純?nèi)獾呐?、羊肉真?shí)性鑒定準(zhǔn)確、可靠;對(duì)于摻假牛、羊肉僅能在一定范圍內(nèi)適用，具有一定的參考性。
　　 5、應(yīng)用五套TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系（引物和TaqManMGB探針）對(duì)整塊肉和碎肉進(jìn)行牛羊肉真實(shí)性鑒定。檢測范圍包括牛肉中摻假豬肉，羊肉中摻假牛、豬或鴨肉。對(duì)于整塊肉，不存在以其他肉類摻假的可能，使用牛和羊的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系建立了通過Ct值直接鑒別牛羊肉真實(shí)性的