生物轉(zhuǎn)化合成阿糖腺苷.pdf

1、阿糖腺苷(vidarabine,9-βD-阿拉伯呋喃糖基腺嘌呤)是一種天然抗病毒核苷類化合物,具有廣譜的抗菌、抗病毒活性。關(guān)于合成阿糖腺苷的方法主要包括化學(xué)合成法和生物合成法,利用化學(xué)合成法合成阿糖腺苷普遍存在步驟多、區(qū)域選擇性差、反應(yīng)條件苛刻、產(chǎn)率低、原料成本高以及環(huán)境污染等問題,而利用微生物核苷磷酸化酶的高選擇性生物轉(zhuǎn)化合成阿糖腺苷是一種理想的方法,目前已成為核苷類藥物合成研究的研究熱點(diǎn)。近年來國(guó)內(nèi)外利用生物酶法合成阿糖腺苷的研究雖

2、然不少,但普遍存在反應(yīng)體系底物與產(chǎn)物濃度較低,菌體酶活不高和生產(chǎn)成本較高等問題,制約了該方法在規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。
　　 本論文研究了利用選擇培養(yǎng)基從土壤中篩選具有高核苷磷酸化酶的菌種資源,結(jié)果通過富集培養(yǎng)篩選到數(shù)十株具有核苷磷酸化酶活性的細(xì)菌;分別對(duì)其核苷磷酸化酶酶活力進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,AEM0812菌株的尿苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶較高,通過分子生物學(xué)16S rDNA初步鑒定為Escherichia sp.AEM08

3、12菌株。對(duì)該菌株進(jìn)行了產(chǎn)酶培養(yǎng)條件分析和產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方優(yōu)化,結(jié)果顯示,該菌株最適培養(yǎng)生長(zhǎng)與產(chǎn)酶溫度為37℃,最適產(chǎn)酶pH7.5-8.0,15L發(fā)酵罐通氣培養(yǎng)最佳產(chǎn)酶發(fā)酵時(shí)間為8-9h,在產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加6％的糖Y、0.08％的營(yíng)養(yǎng)鹽S1、0.08％的營(yíng)養(yǎng)鹽S2和0.06％的營(yíng)養(yǎng)鹽S3既能顯著提高Escherichia sp.AEM0812菌株的酶總量又能提高尿苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶的酶活力。
　　 論文進(jìn)一步研究

4、了利用Escherichia sp.AEM0812菌株的游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化合成阿糖腺苷試驗(yàn),并通過多種鑒定方法(顯色法、高效液相色譜法、紅外光譜法、核磁共振法)對(duì)其合成產(chǎn)物進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示合成產(chǎn)物為阿糖腺苷。對(duì)轉(zhuǎn)化反應(yīng)條件進(jìn)行分析,建立了轉(zhuǎn)化阿糖尿苷酶促合成阿糖腺苷的反應(yīng)體系,結(jié)果顯示,最適轉(zhuǎn)化反應(yīng)溫度為55℃,最適反應(yīng)時(shí)間為65h,磷酸鉀緩沖液最適pH值和濃度分別為7.0、20mmol/L,反應(yīng)底物阿糖尿苷和腺嘌呤最適

5、濃度分別為60mmol/L、71mmol/L。
　　 利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基分別進(jìn)行了100L和300L的放大試驗(yàn),結(jié)果表明利用優(yōu)化后的產(chǎn)酶培養(yǎng)基37℃通氣產(chǎn)酶發(fā)酵12-14h的Escherichia sp.AEM0812菌株游離細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)60h,阿糖尿苷轉(zhuǎn)化率為78.17％,反應(yīng)液阿糖腺苷產(chǎn)物濃度達(dá)9.38g/L。該研究結(jié)果與之前國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究相比較,在底物濃度、產(chǎn)物濃度和阿糖尿苷轉(zhuǎn)化率等方面都得到了大幅度