木質(zhì)纖維素水解組分對(duì)細(xì)菌纖維素合成的影響.pdf

1、細(xì)菌纖維素（Bacterial Cellulose，簡(jiǎn)稱BC）是一類由微生物生產(chǎn)的具有獨(dú)特納米三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的纖維素。它具有高比表面積，高純度、高聚合度、高持水性、高結(jié)晶度、高抗張強(qiáng)度和良好的生物相容性等優(yōu)異性能。作為一種新型的生物材料，BC在紡織、造紙、生物醫(yī)學(xué)工程、功能材料和食品工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用前景，是目前國(guó)際生物材料研究的熱點(diǎn)之一。制約BC大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的主要因素是生產(chǎn)成本高、產(chǎn)率低。用價(jià)格低廉、來(lái)源廣、可再生性的農(nóng)林固體廢棄物

2、等木質(zhì)纖維素原料制備BC，有望降低BC的生產(chǎn)成本。
　　木質(zhì)纖維素通過(guò)預(yù)處理水解生成可發(fā)酵性糖，通常需要高溫高壓酸水解。然而在處理過(guò)程中產(chǎn)生了多種抑制微生物生長(zhǎng)代謝的化合物，主要包括有機(jī)酸（甲酸、乙酸和乙酰丙酸）、呋喃衍生物（糠醛和5-羥甲基糠醛）、芳香族化合物等。這些物質(zhì)的種類及含量與原料的種類、預(yù)處理?xiàng)l件等密切相關(guān)。在以水解物為發(fā)酵碳源時(shí)，這些化合物不僅抑制微生物的生長(zhǎng)代謝，而且影響微生物對(duì)水解液中糖的轉(zhuǎn)化利用。目前，對(duì)這些水

3、解組分的研究主要集中在利用木質(zhì)纖維素發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的領(lǐng)域，譬如這些化合物對(duì)乙醇酵母的生長(zhǎng)和乙醇發(fā)酵的影響上，而關(guān)于其對(duì)于木醋桿菌等細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)BC的影響則未見(jiàn)任何報(bào)道。因此，本文針對(duì)BC的合成機(jī)制，研究木質(zhì)纖維素水解液中主要的糖類、有機(jī)酸類、呋喃醛類和芳香族類化合物對(duì)木醋桿菌合成 BC的影響，包括菌體自身的生長(zhǎng)代謝、培養(yǎng)基中生物轉(zhuǎn)化物質(zhì)的測(cè)定、培養(yǎng)基中 pH值的變化、碳源的消耗以及 BC的產(chǎn)量。通過(guò)對(duì)研究結(jié)果的分析，結(jié)合菌體的代謝途徑，找

4、出起主要抑制作用的化合物，探討了這些物質(zhì)對(duì)于BC合成的影響機(jī)理。并在研究的過(guò)程中建立了一種新型的快速檢測(cè)細(xì)菌活性狀態(tài)數(shù)量的熒光染色方法。
　　本文的主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　1.開(kāi)發(fā)了一種可以快速檢測(cè)培養(yǎng)液中細(xì)菌細(xì)胞活性狀態(tài)的試劑盒，直觀簡(jiǎn)便。試劑盒含有兩種熒光染料，分別是花菁染料 SYBR GreenⅠ和碘化丙啶（PI）。兩種染料的最佳染色濃度分別為4μM和10μg/mL，最佳染色時(shí)間為15 min。將染色的木醋桿菌的

5、熒光強(qiáng)度與所檢測(cè)的菌濃制成雙對(duì)數(shù)曲線，其線性關(guān)系良好，且相關(guān)系數(shù)R2均大于0.98。根據(jù)概率統(tǒng)計(jì)中的t分布，當(dāng)α=0.05，計(jì)算其置信區(qū)間，得出利用此曲線時(shí)所檢測(cè)的菌體濃度范圍需要控制在106至108 cells/mL之間。利用該方法測(cè)得木醋桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的相對(duì)活度％live bacteria(x)與Ratio G/R(y)呈線性關(guān)系，與Invitrogen公司市售試劑盒LIVE/DEAD? BaclightTM Bac

6、terial Viability Kit L7012所檢測(cè)的結(jié)果區(qū)別不大。對(duì)同一樣品進(jìn)行檢測(cè)，熒光染色法比傳統(tǒng)的涂平板法檢測(cè)結(jié)果會(huì)高一個(gè)數(shù)量級(jí)，但是兩者有很好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r2為0.9967。經(jīng)嘗試，該方法不能用于酵母染色。
　　2.以木質(zhì)纖維素水解液中普遍存在的D-葡萄糖，D-木糖，D-甘露糖，D-半乳糖，L-阿拉伯糖，D-阿拉伯糖和常用碳源D-果糖七種糖類作為碳源，在25 g/L和100 g/L兩種濃度下研究比較了對(duì)木醋桿

7、菌和紅茶菌兩種菌株生產(chǎn)BC的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)D-果糖對(duì)兩種菌種都是最合適的碳源。木醋桿菌能夠利用D-木糖和D-半乳糖生產(chǎn)BC。紅茶菌能大量消耗D-甘露糖，但是其BC的得率僅有0.1 g/g，消耗的D-甘露糖主要用于菌體自身的生長(zhǎng)及其他代謝目的。這是首次發(fā)現(xiàn)紅茶菌能夠利用D-甘露糖，而 D-甘露糖在水解液中是很難被其他微生物利用的單糖之一。實(shí)驗(yàn)所得的BC的結(jié)晶度比較高，均高于73.2%。經(jīng)過(guò) SEM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)兩類微生物生產(chǎn)的細(xì)菌纖維素的平均直

8、徑差異不大。
　　3.在培養(yǎng)基中分別添加木質(zhì)纖維素水解液中常見(jiàn)的三種有機(jī)酸化合物（甲酸、乙酸和乙酰丙酸），研究其對(duì)木醋桿菌生長(zhǎng)代謝和BC合成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲酸對(duì)于菌體的抑制作用最強(qiáng)，且這三種有機(jī)酸對(duì)于木醋桿菌的抑制作用強(qiáng)度從大到小的排序?yàn)榧姿?乙酸>乙酰丙酸。木醋桿菌能夠耐受培養(yǎng)基中25 mM的甲酸，當(dāng)甲酸濃度高于100 mM時(shí)，菌體的生長(zhǎng)受到明顯抑制，且測(cè)不到BC的產(chǎn)量。乙酸對(duì)于菌體的抑制作用不明顯,在加入乙酸的培養(yǎng)基中其

9、BC產(chǎn)量與空白培養(yǎng)基中的沒(méi)有明顯變化。當(dāng)培養(yǎng)基中乙酸的初始濃度低于175 mM時(shí)，木醋桿菌能夠代謝乙酸。木醋桿菌不能代謝利用乙酰丙酸，低濃度的乙酰丙酸能夠促進(jìn)木醋桿菌的生長(zhǎng)并有利于BC的生產(chǎn)。在含有初始濃度為100 mM的乙酰丙酸的培養(yǎng)基中，所得的BC的產(chǎn)量為5 g/L，高于空白培養(yǎng)基中的產(chǎn)量3.5 g/L。甲酸對(duì)于木醋桿菌的強(qiáng)抑制作用機(jī)理可以用陰離子的富集理論來(lái)解釋。
　　4.在培養(yǎng)基中分別添加木質(zhì)纖維素水解液中常見(jiàn)的兩種呋喃醛

10、類化合物（糠醛和5-羥甲基糠醛），研究其對(duì)木醋桿菌生長(zhǎng)代謝和BC合成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糠醛比5-羥甲基糠醛對(duì)于木醋桿菌的抑制作用更大。20 mM的糠醛可明顯抑制木醋桿菌，而30 mM的5-羥甲基糠醛才會(huì)對(duì)木醋桿菌產(chǎn)生相同的抑制作用。木醋桿菌能夠?qū)⒌蜐舛瓤啡┺D(zhuǎn)化為糠酸。當(dāng)糠醛初始濃度為10 mM時(shí)，糠醛的轉(zhuǎn)化效率最高，可達(dá)到88%。低濃度的5-羥甲基糠醛可提升BC的產(chǎn)量,木醋桿菌可將5-羥甲基糠醛轉(zhuǎn)化為5-羥甲基-2-糠酸。當(dāng)5-羥甲基糠

11、醛的初始濃度為10 mM時(shí)，5-羥甲基糠酸的產(chǎn)量最高，可達(dá)76%。培養(yǎng)過(guò)程中，木醋桿菌對(duì)于呋喃醛物質(zhì)進(jìn)行的生物氧化還原反應(yīng)可以看成是一種生物脫毒過(guò)程。
　　5.在培養(yǎng)基中分別添加木質(zhì)纖維素水解液中常見(jiàn)的四種芳香族類化合物（松柏醛，阿魏酸，香草醛，4-羥基苯甲酸），研究其對(duì)于木醋桿菌的生長(zhǎng)代謝和BC合成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，松柏醛和香草醛對(duì)于木醋桿菌的抑制作用最強(qiáng)。當(dāng)培養(yǎng)基中松柏醛的初始濃度為2.0 mM時(shí)，能夠完全抑制培養(yǎng)基中菌體的生

12、長(zhǎng)代謝。當(dāng)其濃度低于1.5 mM時(shí)，大部分松柏醛可被轉(zhuǎn)化成阿魏酸和少量的松伯醇。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與松柏醛有著相似分子結(jié)構(gòu)的阿魏酸，在添加相同濃度（0~2 mM）下對(duì)于木醋桿菌的生長(zhǎng)具有一定促進(jìn)作用，但是未明顯影響B(tài)C的產(chǎn)量。當(dāng)香草醛的濃度達(dá)到2.5 mM或更高時(shí)，木醋桿菌的生長(zhǎng)代謝和BC的合成均受到較強(qiáng)抑制。而當(dāng)香草醛初始濃度低于2.5 mM時(shí)，其可被轉(zhuǎn)化成香草醇和少量香草酸。木醋桿菌不能代謝4-羥基苯甲酸。該酚酸對(duì)木醋桿菌的增殖和葡萄糖的消耗

13、速率均無(wú)明顯影響,但是對(duì)于BC的合成具有一定的抑制。結(jié)果表明酚醛類物質(zhì)比酚酸類物質(zhì)具有更大的抑制作用。
　　通過(guò)以上幾部分的研究發(fā)現(xiàn)，木醋桿菌和紅茶菌能夠利用木質(zhì)纖維素水解液中大部分的可發(fā)酵糖作為碳源生產(chǎn)細(xì)菌纖維素，這些糖類物質(zhì)進(jìn)入菌體后參與的代謝網(wǎng)絡(luò)的差異可能導(dǎo)致菌體對(duì)于不同單糖的利用效率不同。水解液中的芳香族化合物對(duì)于木醋桿菌的抑制作用明顯大于有機(jī)酸和呋喃醛。木醋桿菌對(duì)于有機(jī)酸有較高的耐受性，對(duì)于低濃度的酚醛類和呋喃醛類化合物