木質(zhì)纖維素水解液抑制物高抗性酵母的選育.pdf

1、纖維素水解液抑制物對(duì)微生物的毒害作用是纖維素乙醇發(fā)展面臨的主要瓶頸問(wèn)題之一。本文主要借助分子生物學(xué)相關(guān)手段和進(jìn)化工程方法來(lái)選育纖維素水解液抑制物抗性提高的酵母菌株。一方面，通過(guò)基因工程改造等手段實(shí)現(xiàn)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的過(guò)表達(dá)來(lái)構(gòu)建抗性提高的釀酒酵母;另一方面，通過(guò)定向馴化的方法來(lái)篩選得到具有良好抑制物抗性的酵母菌株。
　　首先，利用基因工程改造相關(guān)手段獲得膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ADP1，STE6, MDR1，TPO1過(guò)表達(dá)的釀酒酵母菌株Sac

2、charomyces cerevisiae280/959-PGK-ADP1/MDR1/STE6/TPO1和空載對(duì)照菌株S.cerevisiae280/959-PGK。并通過(guò)抑制物脅迫條件下的梯度稀釋實(shí)驗(yàn)和發(fā)酵實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明:在甲酸、乙酸、糠醛等抑制物脅迫條件下，過(guò)表達(dá)菌株S.cerevisiae280-PGK-MDR1和S.cerevisiae959-PGK-ADP1在生長(zhǎng)速率、耗糖速率、乙醇生產(chǎn)強(qiáng)度等方面與其對(duì)照菌株相比具有明

3、顯優(yōu)勢(shì)。
　　其次，本研究利用進(jìn)化工程的方法對(duì)釀酒酵母模式菌株S.cerevisiae959在含有甲酸、乙酸的條件下分別進(jìn)行了定向馴化，并將馴化后的菌株進(jìn)行抑制物抗性的考察和驗(yàn)證。結(jié)果表明，馴化后的菌株在相應(yīng)抑制物的脅迫條件下仍然可以以較快的速率生長(zhǎng)，消耗葡萄糖并生成乙醇。此外，經(jīng)過(guò)甲酸馴化后的菌株對(duì)乙酸和混合酸的抗性也得到了提高，而經(jīng)過(guò)乙酸馴化的菌株在甲酸或混合酸存在的條件下與對(duì)照菌株相比并沒(méi)有特別明顯的優(yōu)勢(shì)。
　　在上述

4、實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究對(duì)能夠天然利用多種碳源（己糖和戊糖）的馬克斯克魯維酵母進(jìn)行了定向馴化，其馴化條件為模擬纖維素水解液中的混合抑制物條件，同時(shí)對(duì)馴化后的菌株進(jìn)行了抑制物抗性的考察和發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果表明，馴化后的菌株與出發(fā)菌株相比，對(duì)纖維素水解液抑制物的抗性顯著提高。此外，經(jīng)過(guò)馴化后的菌株K.marxianus1727-1和K.marxianus1727-5不僅在抑制物抗性方面表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)，對(duì)木糖的消耗速率也有了顯著提高。