維生素C兩步發(fā)酵中關鍵步驟的分子生物學研究.pdf

1、在維生素C兩步發(fā)酵工藝中，第一步為醇糖轉化，即在葡糖桿菌作用下D-山梨醇轉化為L-山梨糖；第二步為糖酸轉化，在普通生酮基古龍酸菌(Ketogulonigeniumvulgare，俗稱小菌)與其伴生菌(俗稱大菌)組成的混合菌系的作用下L-山梨糖轉化為維生素C的前體2-酮基-L-古龍酸(KGA)。維生素C兩步發(fā)酵實質上就是D-山梨醇和L-山梨糖的專一性生物氧化過程。闡明這一系列生物氧化過程的生化反應機制對于指導維生素C的遺傳育種甚至通過代謝

2、工程構建由山梨醇到KGA的一步發(fā)酵工程菌，都具有重要意義。 本課題組已從小菌細胞裂解物中分離得到了催化山梨糖生物氧化的一種關鍵酶——山梨糖脫氫酶(SDH)，該酶能夠將L-山梨糖直接轉化為KGA；同時構建了小菌的基因文庫，并以SDH的抗體篩選文庫，分離得到編碼SDH的基因(sdh)。 本文在上述工作基礎上，首先在大腸桿菌中對山梨糖脫氫酶進行了高效表達，對表達產物進行了純化，研究了該酶的最適反應溫度、最適反應pH值、酶穩(wěn)定性

3、、米氏反應常數、酶的激活劑和抑制劑、金屬離子的激活與抑制作用等重要性質。 研究葡糖桿菌對山梨糖脫氫酶的影響。以氨甲酰化酶基因(hyuC)為報告基因，構建了山梨糖脫氫酶-氨甲酰化酶融合表達載體，在大腸桿菌中可以同時檢測到山梨糖脫氫酶和氨甲?；富钚?；而在葡糖桿菌中，只能檢測到氨甲?；富钚裕礄z測到山梨糖脫氫酶活性。質粒穩(wěn)定性實驗和質?；剞D實驗說明該質粒在葡糖桿菌中穩(wěn)定存在。由于hyuC基因位于sdh基因下游，融合基因的轉錄和翻譯

4、是從山梨糖脫氫酶到氨甲?；福奔柞；冈谄咸菞U菌中表達說明包含山梨糖脫氫酶在內的融合蛋白能夠在葡糖桿菌中轉錄并翻譯，山梨糖脫氫酶可能被宿主的酶系降解失活。 通過體外實驗也證實葡糖桿菌裂解物對山梨糖脫氫酶具有降解作用。將山梨糖脫氫酶與葡糖桿菌裂解液保溫過夜后，通過SDS-PAGE檢測到電泳圖譜上約60kD和49kD處出現兩條明顯條帶，對這兩條帶進行蛋白質N-端序列分析，結果顯示其N端的前3個氨基酸殘基均為谷氨酰胺-蘇氨酸-丙氨酸

5、，推測49kD的蛋白條帶是由60kD山梨糖脫氫酶蛋白C-端降解產生。對預測的sdh讀框N-端蛋氨酸至谷氨酰胺之間23肽氨基酸序列分析，發(fā)現23個氨基酸中大部分氨基酸為疏水氨基酸，并與醇脫氫酶的信號肽序列有38％的同源性，推測山梨糖脫氫酶N-端的23肽可能是一段信號肽，與該酶在細胞膜上的定位相關。 本文成功建立了葡糖桿菌Tn5誘變系統，實現了mini-Tn5轉座對葡糖桿菌的誘變，并從1032株突變株中篩選得到能夠利用山梨醇而不能利