CO-,2-氣腹對胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性及侵襲轉(zhuǎn)移能力影響的臨床與基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的：胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，也是最易發(fā)生腹腔種植轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤，目前手術(shù)切除仍然是治療胃癌最有效的方法。近年來，由于微創(chuàng)外科的發(fā)展，特別是其創(chuàng)傷小、出血少、術(shù)后恢復(fù)快等微創(chuàng)特點使其逐步深入腹部外科的各個領(lǐng)域。腹腔鏡結(jié)直腸癌手術(shù)已經(jīng)被證實具有與開腹手術(shù)相當(dāng)甚至優(yōu)于開腹手術(shù)的早期和遠(yuǎn)期療效。但由于腹腔鏡胃癌手術(shù)開展較晚，隨機對照研究病例較少，目前尚處于探索階段。在這一背景下，西南醫(yī)院普通外科于2004年成立微創(chuàng)胃腸外科中心，

2、系統(tǒng)研究腹腔鏡胃癌根治術(shù)的技術(shù)方法和臨床應(yīng)用可行性。本研究一方面從臨床病例入手，通過檢測腹腔鏡胃癌根治術(shù)對腹腔脫落胃癌細(xì)胞和腹膜超微結(jié)構(gòu)的影響，探討腹腔鏡手術(shù)是否會促進(jìn)胃癌細(xì)胞的脫落和種植。另一方面，我們于體外建立人工氣腹模型，設(shè)立不同種類、不同壓力氣腹環(huán)境，通過對氣腹環(huán)境下胃癌細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞周期、凋亡比例、遷移運動、細(xì)胞骨架以及裸鼠移植瘤的研究，探討CO2氣腹對胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性和侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。最后，檢測不同壓力CO2氣腹下

3、胃癌細(xì)胞細(xì)胞周期蛋白和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化，對其分子機制進(jìn)行初步探討。 方法：(1)收集同期開展的腹腔鏡胃癌和開腹胃癌手術(shù)病人腹腔沖洗液，應(yīng)用細(xì)胞學(xué)和熒光定量PCR法檢測腹腔脫落游離癌細(xì)胞和CEA mRNA。再獲取腹腔鏡胃癌和開腹胃癌手術(shù)病人腹膜和胃漿膜標(biāo)本，常規(guī)固定制樣，掃描電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)改變。(2)建立體外人工氣腹模型，分別以CO2和混合氣體作為膨腹介質(zhì)，設(shè)定壓力為0、10、12和15mmHg。分別應(yīng)用MTT酶標(biāo)儀、流

4、式細(xì)胞儀、Boyden小室和免疫熒光激光共聚焦顯微鏡檢測不同種類、不同壓力氣腹環(huán)境對胃癌MKN-45細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞周期、凋亡比例、遷移運動和細(xì)胞骨架的影響。(3)將不同種類、不同壓力環(huán)境下培養(yǎng)的MKN-45細(xì)胞接種于裸鼠皮下，觀察裸鼠移植瘤成瘤時間、腫瘤大小和Ki-67表達(dá)變化。(4)分別應(yīng)用RTl-PCR、Western-blot、免疫沉淀、免疫組化方法檢測不同壓力CO2氣腹對胃癌MKN-45細(xì)胞Cyclin D1、CDK4、Rb

5、、磷酸化Rb、Bcl-2/Bax以及Cyclin D1和CDK4結(jié)合能力的影響。 結(jié)果：(1)腹腔鏡胃癌根治術(shù)組和開腹胃癌根治術(shù)組腹腔游離胃癌細(xì)胞的檢出率和CEA mRNA陽性率無顯著差異(P>0.05)；腹腔游離癌細(xì)胞檢出率與腫瘤浸潤深度、漿膜受侵面積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)。腹腔鏡胃癌根治術(shù)組腹膜間皮細(xì)胞腫脹、細(xì)胞間隙增寬，而開腹胃癌根治術(shù)組腹膜間皮細(xì)胞形態(tài)無明顯改變、細(xì)胞間連接緊密。兩組胃漿膜超微結(jié)構(gòu)無顯著差異。(

6、2)CO2氣腹組胃癌MKN-45細(xì)胞培養(yǎng)液pH值下降非常顯著，且壓力越大pH值降低越明顯。混合氣體組胃癌MKN-45細(xì)胞培養(yǎng)液pH值與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。(3)0、10、12、15mmHg混合氣體氣腹組和0、10、12.mmHg CO2氣腹組與對照組比較增殖活性無顯著性差異(P>0.05)，15mmHg CO2氣腹組增殖活性在前3天無顯著性差異，在4～7天下降非常顯著(P<0.01)。15mmng CP2氣腹組胃癌M

7、KN-45細(xì)胞增殖指數(shù)與對照組比較顯著下降(P<0.05)，凋亡比例增加非常顯著(P<0.01)，而0、10、12 mmHg CO2氣腹組和0、10、12、15mmHg混合氣體氣腹組與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。(4)15mmHg CO2氣腹組胃癌MKN-45細(xì)胞穿過濾膜數(shù)量與對照組比較顯著下降(P<0.01)，F(xiàn)-actin表達(dá)明顯減少，結(jié)構(gòu)松散，微管蛋白β-tubulin表達(dá)較對照組減弱、稀疏。而0、10、12 mmHg

8、CO2氣腹組和0、10、12、15mmHg混合氣體氣腹組與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。(5)15mmHg CO2氣腹組胃癌MKN-45細(xì)胞Cyclin D1、CDK4在mRNA和蛋白水平均顯著下降(P<0.05)，二者結(jié)合能力也顯著下降(P<0.05)。Rb蛋白在mRNA和蛋白水平與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)，但磷酸化Rb蛋白則顯著低于對照組(P<0.05)。免疫組化染色顯示Bcl-2/Bax表達(dá)在15mmHg

9、CO2氣腹組明顯低于對照組和0、10、12 mmHg CO2氣腹組(P<0.05)。(6)15mmHg CO2氣腹組裸鼠移植瘤體積、重量、Ki-67陽性率與對照組比較顯著下降(P<0.05)，0、10、12 mmHg CO2氣腹組和0、10、12、15mmHg混合氣體氣腹組與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論：(1)腹腔鏡胃癌根治術(shù)與開腹胃癌根治術(shù)比較并不增加腹腔游離胃癌細(xì)胞的檢出率，腹腔游離胃癌細(xì)胞檢出率與腫瘤浸潤

10、深度、漿膜受侵面積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)。(2)腹腔鏡胃癌根治術(shù)CO2氣腹對壁層腹膜影響較大，主要表現(xiàn)在間皮細(xì)胞腫脹、細(xì)胞間連接斷裂、細(xì)胞間隙增寬、基底層組織暴露，而對胃壁漿膜影響較小。(3)0、10、12mmHg CO2氣腹和0、10、12、15mmHg混合氣體氣腹對胃癌MKN-45細(xì)胞增殖活性、增殖指數(shù)凋亡比例的影響與對照組比較無顯著差異。15mmHg CO2氣腹顯著降低胃癌MKN-45細(xì)胞的增殖活性、增殖指數(shù)，增加其凋亡

11、比例。(4)15mmHg CO2氣腹抑制胃癌MKN-45細(xì)胞的遷移運動能力。在15mmHg CO2氣腹環(huán)境下胃癌MKN-45細(xì)胞的微絲微管表達(dá)減弱、結(jié)構(gòu)松散、排列混亂，這可能是其運動能力減弱的因素之一。(5)0、10、12mmHg CO2氣腹和0、10、12、15mmHg混合氣體氣腹對胃癌MKN-45細(xì)胞裸鼠移植瘤成瘤時間、腫瘤體積、腫瘤重量無顯著影響，而15mmHg CO2氣腹可以顯著延長裸鼠移植瘤成瘤時間，抑制腫瘤體積和重量。同時，