EphrinB2對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的:在體外實(shí)驗(yàn)中研究利用RNA干擾技術(shù)沉默EphrinB2基因?qū)Y(jié)直腸癌生物學(xué)行為的影響，并探討其可能的機(jī)制，為結(jié)直腸癌的早期診斷和基因治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:用Western Blot與RT-PCR分別檢測(cè)SW480、SW620、LOVO、HT29細(xì)胞中EphrinB2蛋白及mRNA表達(dá)水平篩選出高表達(dá)EphrinB2的結(jié)直腸癌細(xì)胞SW480;將三個(gè)干擾質(zhì)粒(Psilencer2.1-E65，Psilenc

2、er2.1-E376，Psilencer2.1-E730)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞（外篩），用RT-PCR和Western Blot檢測(cè)EphrinB2 mRNA和蛋白的表達(dá)情況，篩選干擾效果最好的干擾質(zhì)粒;然后轉(zhuǎn)染入高表達(dá)EphrinB2的結(jié)直腸癌細(xì)胞（內(nèi)驗(yàn)），將實(shí)驗(yàn)分3組:①空白對(duì)照組(CON):不轉(zhuǎn)染質(zhì)粒②陰性對(duì)照組(NC):轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒③RNA干擾組(RNAi):轉(zhuǎn)染pSilencer2.1-EphrinB2-shRNA376;流式細(xì)胞

3、儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡，篩選建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株;對(duì)上述3組細(xì)胞采用Western Blot與RT-PCR分別檢測(cè)EphrinB2、VEGF、CD105、MMP9蛋白及mRNA的表達(dá)水平;用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期變化，用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲能力的變化，用劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定各組細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖率。
　　 結(jié)果:結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中EphrinB2表達(dá)水平最高;用293T細(xì)胞外篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:含

4、Psilencer2.1-E376干擾序列的質(zhì)粒干擾效果最好(EphrinB2蛋白表達(dá)量顯著減少);成功將沉默效果明顯的pSilencer2.1-EphrinB2-shRNA376轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞凋亡百分比CON組（1.97±0.47）及NC組(1.74±0.36)較RNAi組(26.69±0.66)明顯降低(P＜0.05);建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株;與CON組、NC組比較RNAi組SW480細(xì)胞EphrinB2、VEG

5、F、CD105、MMP9的蛋白及mRNA表達(dá)水平均明顯下降(P＜0.05)，而CON組與NC組比較差異無顯著性(P＞0.05);流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞S期細(xì)胞百分比RNAi組（18.32±0.38）較CON組(25.22±0.89)及NC組(24.34±1.26)明顯降低(P＜0.05)，G1期細(xì)胞百分比RNAi組（74.49±1.55）較CON組(55.98±1.66)及NC組(57.78±2.22)明顯增高(P＜0.05);Transw

6、ell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:RNAi組穿膜細(xì)胞數(shù)量(37.33±5.51)較CON組(109±4.36)及NC組（102±4.58）明顯減少(P＜0.05);劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:RNAi組遷移距離（18.33±0.71）較CON組(32.7±1.25)及NC組(30.57±1.36)明顯縮短(P＜0.05); MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:RNAi組細(xì)胞增殖水平較CON組及NC組明顯降低(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:RNAi干擾技術(shù)能有效沉默Ep