載ADM-PLGA微球的納米羥基磷灰石膠原多孔支架的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、骨肉瘤是人類(lèi)在15-20歲這一時(shí)期內(nèi)多發(fā)的常見(jiàn)惡性腫瘤。骨肉瘤患者在20世紀(jì)70年代之前主要通過(guò)手術(shù)進(jìn)行治療，但是在行手術(shù)切除腫瘤之后患者的生存率不足20％。目前我國(guó)作為世界第一人口大國(guó)，因骨腫瘤致死或造成殘疾、功能障礙人數(shù)也逐年增多，位居世界各國(guó)之首。
　　關(guān)于骨腫瘤的手術(shù)治療，其主要問(wèn)題不僅在于手術(shù)切除后常常殘存部分未完全切除的腫瘤組織，這是一個(gè)復(fù)發(fā)的極大隱患，而且還有一個(gè)很大的弊端就是在手術(shù)切除腫瘤病灶的同時(shí)切除了病灶處的負(fù)

2、重骨骼;某些發(fā)生在特定部位的腫瘤，特別是脊柱腫瘤，因?yàn)槠浒l(fā)生部位的特殊造成了其常常難以切除，此外，腫瘤組織的跳躍轉(zhuǎn)移以及在手術(shù)中這些組織與正常組織結(jié)構(gòu)的接觸帶來(lái)的醫(yī)源性播散，這些都有可能引起手術(shù)后腫瘤的局部復(fù)發(fā)。因此，在骨腫瘤切除術(shù)后往往需要進(jìn)行化療，在臨床上目前使用最廣泛的傳統(tǒng)的化療藥物比如阿霉素、順鉑、長(zhǎng)春堿類(lèi)這些藥物不僅具有抗腫瘤活性，也因?yàn)樗鼈兤鹦У姆沁x擇性對(duì)人體內(nèi)的各個(gè)組織和器官帶來(lái)了相應(yīng)的毒副作用，常規(guī)治療劑量即可對(duì)人體產(chǎn)生

3、明顯的骨髓移植、心臟毒性、胃腸道反應(yīng)等毒副作用，這些毒副作用降低了患者的治療的依從性和生活質(zhì)量，容易引起患者對(duì)治療的抗拒，通?；熕幬锞哂袝r(shí)間和劑量的依賴(lài)，高藥物濃度，較長(zhǎng)的半衰期常?？梢詭?lái)更好的抗腫瘤效果，但是劑量的提高和用藥時(shí)間的延長(zhǎng)通常會(huì)帶來(lái)更加嚴(yán)重甚至致命的毒副作用。在漫長(zhǎng)的臨床實(shí)踐中人們渴望獲得一種可以提高局部藥物濃度，延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間的新的化療藥物來(lái)減少化療相關(guān)毒副作用，提高化療效率。隨著制藥技術(shù)的進(jìn)步，局部緩釋藥物的概念

4、被提出，其思路是緩釋藥物，延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間并且局部靶向給藥，提高藥物的選擇性;而隨著骨組織工程技術(shù)的發(fā)展，將局部緩釋藥物與仿生的人工骨材料相結(jié)合制備成為在局部植入后可以靶向選擇性給藥并且能夠修復(fù)手術(shù)造成的負(fù)重骨骼缺損，這種思路為骨腫瘤患者的康復(fù)帶來(lái)了新的希望。
　　藥物局部緩釋系統(tǒng)在腫瘤的治療方面具有良好的應(yīng)用前景，這種系統(tǒng)是將一系列具有良好生物相容性、可降解性的無(wú)機(jī)或有機(jī)材料與一種或者是幾種傳統(tǒng)的化療藥物相結(jié)合，通過(guò)不同的給藥途

5、徑植入腫瘤切除術(shù)后的原病灶處或者是病灶周?chē)慕M織內(nèi)，由此達(dá)到類(lèi)似于靶向給藥的目的。藥物局部緩釋給藥系統(tǒng)對(duì)于局部的殘存的腫瘤細(xì)胞、病灶可以作用較長(zhǎng)的時(shí)間，藥物不需要通過(guò)生物代謝，腫瘤細(xì)胞在一個(gè)較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)暴露在較高濃度的化療藥物下，顯著提高了化療藥物的治療效率，同時(shí)相對(duì)于傳統(tǒng)給藥途徑來(lái)說(shuō)其避免了長(zhǎng)時(shí)間的全身給藥誘發(fā)的各種毒副反應(yīng)。晚期癌癥患者或是不能耐受傳統(tǒng)化療的患者，藥物緩釋系統(tǒng)植入可以增大給藥劑量，局部釋放的藥物可對(duì)腫瘤長(zhǎng)時(shí)間的直接起

6、效，這對(duì)提高晚期患者的生活質(zhì)量以及延長(zhǎng)壽命也有一定的幫助。
　　納米顆粒(nano-particle)有著獨(dú)特的表征和理化性質(zhì)，小的尺寸、體積使這類(lèi)微粒更容易穿透細(xì)胞屏障進(jìn)入組織間隙，顯著的提高了被細(xì)胞吞噬的能力，此外納米顆粒還可以增加藥物的穩(wěn)定性和可溶性，同時(shí)在改善腎臟的清除率方面可以起到重要作用。在腫瘤組織中的遲滯效應(yīng)（EPR效應(yīng)）的基礎(chǔ)上，納米藥物可以選擇性、特異性的通過(guò)配體誘導(dǎo)的細(xì)胞表面的胞吞作用增加藥物的攝入，在進(jìn)一步提

7、高療效的同時(shí)減少腫瘤的耐藥，通過(guò)減少對(duì)非目標(biāo)部位細(xì)胞組織器官的損傷，來(lái)降低毒性。此外因?yàn)榧{米材料有其獨(dú)特的小尺寸、表面或界面效應(yīng)，納米級(jí)別的羥基磷灰石這類(lèi)材料可以有效地誘導(dǎo)骨組織再生和細(xì)胞生長(zhǎng)，因此在骨傳導(dǎo)性能上其與傳統(tǒng)的毫米、微米材料相比較具有明顯優(yōu)勢(shì)。
　　局部藥物緩釋理念，隨著骨支架修復(fù)材料、抗腫瘤藥物的發(fā)展，在納米醫(yī)學(xué)的新生土壤之上，有望繼續(xù)發(fā)揮優(yōu)勢(shì)，開(kāi)發(fā)出性能更佳的抗腫瘤納米緩釋包囊和支架材料。我們課題組構(gòu)建了載ADM-

8、PLGA微球的納米羥基磷灰石膠原多孔支架(ADM-PLGA-NHAC)，并對(duì)其表征和骨修復(fù)能力及抗腫瘤活性進(jìn)行了相關(guān)檢測(cè)。
　　目的:
　　通過(guò)制備搭載了阿霉素(ADM)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)納米緩釋微球的納米羥基磷灰石/膠原多孔支架(ADM-PLGA-NHAC)，并進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)這種材料的理化性質(zhì)、釋藥特點(diǎn)以及驗(yàn)證其體內(nèi)、體外的抗腫瘤能力和骨修復(fù)能力，為本材料的臨床實(shí)驗(yàn)打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，為臨床骨肉瘤的治療提供新

9、的思路。
　　方法:
　　1.復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法加工阿霉素(ADM)-聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)緩釋微球;納米羥基磷灰石/膠原多孔支架(NHAC)通過(guò)冷凍干燥法以納米羥基磷灰石及膠原為原料進(jìn)行制備，在NHAC的制備過(guò)程中加入ADM-PLGA微球制得載ADM-PLGA納米微球的納米羥基磷灰石/膠原多孔支架(ADM-PLGA-NHAC)。制備完成后材料在體外通過(guò)透析袋擴(kuò)散法及制備浸提液進(jìn)行材料的藥物釋放動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)和抗腫瘤實(shí)

10、驗(yàn)，再通過(guò)掃描電鏡(SEM)、激光粒徑儀等對(duì)微球和支架的表征進(jìn)行相關(guān)測(cè)試。
　　2.新西蘭大白兔的臨界骨缺損模型選擇來(lái)作為本實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型，造模完成后的動(dòng)物隨機(jī)分為3組:A組骨缺損不予處理作為空白對(duì)照組;B組骨缺損處以NHAC填塞;C組骨缺損處植入載ADM-PLGA-NHAC。在手術(shù)完成后的第8周及12周處死動(dòng)物，并對(duì)股骨標(biāo)本行X線檢查，所得X線結(jié)果根據(jù)Lane-Sandhu標(biāo)準(zhǔn)對(duì)骨缺損的愈合情況進(jìn)行評(píng)價(jià);X線檢查完成后對(duì)各組的骨

11、標(biāo)本進(jìn)行Micro-CT掃描，掃描圖像導(dǎo)入電腦進(jìn)行3維重建，之后再將掃描數(shù)據(jù)導(dǎo)入Micro-CT自帶的分析軟件進(jìn)行BMD值分析，對(duì)骨缺損修復(fù)情況進(jìn)行定量的分析;骨標(biāo)本行組織學(xué)檢測(cè)（HE、MASSON染色）及掃描電鏡(SEM)檢測(cè)根據(jù)結(jié)果判斷標(biāo)本的骨修復(fù)情況及材料降解情況。
　　3.將MG63細(xì)胞接種于裸鼠皮下，成瘤后裸鼠皮下腫瘤以尖刀片隨機(jī)植入材料，實(shí)驗(yàn)終止時(shí)處死全部裸鼠，腫瘤剝離、稱(chēng)重并測(cè)量腫瘤長(zhǎng)、寬計(jì)算腫瘤體積。并將腫瘤重量、

12、腫瘤體積進(jìn)行比較;將裸鼠皮下腫瘤按照標(biāo)準(zhǔn)程序制作石蠟切片（厚度4um），行HE染色觀察腫瘤轉(zhuǎn)移、壞死以及心臟毒性，進(jìn)行腫瘤組織TUNEL檢測(cè)并計(jì)算壞死率。
　　4.所有的統(tǒng)計(jì)分析均由SPSS13.0軟件完成。具體數(shù)據(jù)均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示，多組間資料采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間比較采用LSD法(least significant difference)，若方差不齊則采用Durnett's T3法

13、進(jìn)行檢驗(yàn);P值＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.本課題組由乳化揮發(fā)法制得的ADM-PLGA納米微球呈圓球形，平均粒徑約為319.5nm±11.17nm，其載藥率為(6.42±0.28)％。制備的ADM-PLGA-NHAC復(fù)合支架，其孔徑經(jīng)測(cè)試約為100-200um，孔隙率可達(dá)到約(82.3±4.6)％，材料多孔而且空洞的內(nèi)壁十分粗糙，有利于細(xì)胞黏附及營(yíng)養(yǎng)交換。釋藥曲線顯示藥物并未出現(xiàn)明顯的突釋現(xiàn)象，24h

14、內(nèi)藥物釋放率約為17.6％，本材料在28d內(nèi)能持續(xù)緩慢釋放ADM，且釋放濃度比較穩(wěn)定。通過(guò)活-死染色及CCK8法檢測(cè)材料的抗腫瘤效果，結(jié)果顯示ADM-PLGA-NHAC材料的浸提液在體外隨著濃度和時(shí)間的增長(zhǎng)可以明顯抑制MG63細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　2.建立新西蘭兔股骨髁骨缺損模型后植入材料，在手術(shù)后的第8周及12周取材進(jìn)行X線攝片分析、Micro-CT掃描3維重建并進(jìn)行BMD值分析，結(jié)果顯示:空白對(duì)照組骨缺損未愈合而載藥的ADM-PL

15、GA-NHAC支架組與未載藥物的NHAC支架組骨愈合程度無(wú)明顯差異。在石蠟切片組織學(xué)檢測(cè)中顯示A組（空白對(duì)照組）未見(jiàn)明顯新骨形成;B組(NHAC組)可見(jiàn)尚未降解的填充材料與散在其間的大量不規(guī)則的新骨組織，新生骨組織開(kāi)始融合;C組（ADM-PLGA-NHAC組）材料降解程度與B組接近，但不規(guī)則的新骨組織數(shù)量及新生骨組織融合程度差于B組。12周末時(shí)A組在骨缺損邊緣處可見(jiàn)少量不規(guī)則新生骨組織，而B(niǎo)組、C組均可見(jiàn)較多的成熟骨組織和骨類(lèi)似組織融合

16、成片且大量的新生骨質(zhì)與膠原廣泛融合且呈片狀，局部仍可見(jiàn)少量尚未降解的填充材料，兩組均未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及組織壞死。
　　3.裸鼠處死后以肉眼觀察肺組織有無(wú)轉(zhuǎn)移瘤，對(duì)剝離干凈的腫瘤進(jìn)行稱(chēng)重、測(cè)量體積，分別進(jìn)行HE染色及TUNEL檢測(cè)，結(jié)果顯示ADM-PLGA-NHAC組的抑瘤效果最好，各組均肺部無(wú)轉(zhuǎn)移，而在腹腔注射阿霉素組裸鼠出現(xiàn)心臟毒性，而其他各組心臟未見(jiàn)明顯異常。
　　結(jié)論:
　　1.我們課題組將納米級(jí)別的化療藥物

17、緩釋囊與納米級(jí)別的羥基磷灰石相結(jié)合，通過(guò)乳化揮發(fā)法、冷凍干燥法研制出了載ADM-PLGA納米囊的納米羥基磷灰石/膠原多孔支架并在體外通過(guò)一系列理化檢測(cè)證明了其具有良好粒徑、孔隙率、載藥率、緩釋性能及抗腫瘤能力;
　　2.通過(guò)建立新西蘭兔股骨髁骨缺損模型并植入我們制備的ADM-PLGA-NHAC材料，在8周后及12周后分別進(jìn)行X線、Micro-CT以及組織學(xué)等檢測(cè)，結(jié)果充分證實(shí)了載ADM-PLGA納米囊的納米羥基磷灰石/膠原多孔支架