miR-370對(duì)肝細(xì)胞癌的作用及其臨床意義.pdf

1、[研究背景及目的]
　　 肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的惡性腫瘤之一。我國(guó)所處的亞太地區(qū)是HCC的高發(fā)區(qū)。近年來，HCC的診斷治療上取得許多進(jìn)展，但由于其進(jìn)展迅速，很多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已錯(cuò)過根治治療時(shí)機(jī);且HCC對(duì)現(xiàn)有的放療、化療等方法不敏感，因此，其死亡率高，預(yù)后差，臨床迫切需要尋找新的治療方案。
　　 微小RNA(microRNA，miRNA)在細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、細(xì)胞

2、周期調(diào)控等許多生理過程中發(fā)揮重要作用，其異常表達(dá)亦與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR-370位于人類14號(hào)染色體長(zhǎng)臂上的DLK1-DIO3印記基因區(qū)域，在許多惡性腫瘤如膀胱癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、急性髓細(xì)胞白血病，口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào)。在膽管細(xì)胞癌中，miR-370通過下調(diào)癌基因絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶8（mitogen-activated protein kinase kinase kinase8，MAP3K8）的表達(dá)來抑制腫瘤

3、細(xì)胞的增殖。在急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞中上調(diào)miR-370表達(dá)后，其靶基因叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子M1（Forkhed box M1，F(xiàn)oxM1）的表達(dá)下調(diào)，并顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和克隆形成能力。miR-370在口腔鱗狀上皮細(xì)胞癌中通過下調(diào)胰島素受體底物1（insulin receptorsubstratre-1，IRS-1）的表達(dá)而顯著抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。然而，miR-370在腫瘤中的作用尚有爭(zhēng)議。有研究表明miR-370在胃癌、前列腺

4、癌中表達(dá)升高，上調(diào)miR-370表達(dá)可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。以上研究表明miR-370對(duì)不同腫瘤細(xì)胞存在不同作用，而miR-370在HCC中的作用尚未見報(bào)道。
　　 本課題旨在觀察miR-370對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，分析其與肝癌患者臨床惡性表型和預(yù)后的相關(guān)性，探討miR-370在肝癌中的作用，為肝癌治療提供新的靶點(diǎn)。
　　 [實(shí)驗(yàn)方法]
　　 一、 miR-370在肝癌組織中的表達(dá)
　　 （一）比較人肝細(xì)胞

5、株和人肝腫瘤細(xì)胞株中miR-370的差異表達(dá)
　　 培養(yǎng)人永生化肝細(xì)胞株(human nontransformed immortalized hepatocytes，IMH)及人肝腫瘤細(xì)胞株Hep3B、HepG2、Huh7、MHCC-LM3、PLC/PRF/5、YY-8103、MHCC-97H、SMMC-7721、QGY-7703、Focus、SK-Hep-1。抽取細(xì)胞總RNA，real-timePCR法檢測(cè)miR-370的表達(dá)

6、情況。
　　 （二）檢測(cè)DEN模型大鼠肝臟組織中miR-370表達(dá)
　　 腹腔注射二乙基亞硝胺（diethylinitrosamine，DEN），按70 mg/kg劑量腹腔注射，每周注射1次，連續(xù)注射10w，制備DEN誘導(dǎo)的大鼠肝癌模型。分別取正常、DEN開始注射后10W、18W、22W的大鼠肝組織，real-time PCR法檢測(cè)miR-370表達(dá)。
　　 （三）比較人肝癌組織及癌旁組織中miR-370的差異表

7、達(dá)
　　 收集20對(duì)人肝癌組織及相應(yīng)的癌旁組織，抽取總RNA，real-time PCR法檢測(cè)miR-370的表達(dá)情況。
　　 二、 miR-370對(duì)人肝癌細(xì)胞的生物學(xué)作用
　　 （一）miR-370對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力影響
　　 利用化學(xué)合成的miR-370擬似物(miR-370mimic)上調(diào)肝癌細(xì)胞株MHCC-97H、YY-8103、PLC/PRF/5中miR-370的表達(dá)，或利用2'-甲氧修飾的mi

8、R-370互補(bǔ)鏈(miR-370 inhibitor)抑制其在肝癌細(xì)胞MHCC-97H、PLC/PRF/5中的作用，用Cellcounting kit8(CCK8)法檢測(cè)細(xì)胞在波長(zhǎng)為450nm時(shí)的光密度值(OD)，連續(xù)檢測(cè)5天，繪制生長(zhǎng)曲線。
　　 （二）miR-370對(duì)肝癌細(xì)胞克隆形成能力影響
　　 種植于24孔板的肝癌細(xì)胞株P(guān)LC/PRF/5、YY-8103、MHCC-97H分別轉(zhuǎn)染pcDNA-miR-370和對(duì)照質(zhì)

9、粒pcDNA3.0，24小時(shí)后分至10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿(PLC/PRF/5、MHCC-97H3000個(gè)細(xì)胞/皿，YY-81031000個(gè)細(xì)胞/皿)，培養(yǎng)至克隆可見時(shí)（約2周后）用考馬斯亮藍(lán)染色，拍照并分析miR-370對(duì)肝癌細(xì)胞克隆形成能力的影響。
　　 三、miR-370的表達(dá)與肝癌患者臨床惡性表型和預(yù)后的關(guān)系
　　 （一）比較人正常肝組織、肝癌組織及癌旁組織中miR-370的差異表達(dá)
　　 收集24例正常人肝組

10、織、86對(duì)肝癌標(biāo)本及相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本，Ambion試劑盒抽提總RNA，real-time PCR檢測(cè)miR-370表達(dá)情況。
　　 （二）miR-370表達(dá)與肝癌臨床惡性表型的相關(guān)性
　　 按miR-370表達(dá)的中位數(shù)將上述86對(duì)HCC標(biāo)本分為miR-370高表達(dá)組和miR-370低表達(dá)組。分析miR-370表達(dá)與甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)、腫瘤分化程度、腫瘤大小、腫瘤個(gè)數(shù)、TNM分期、是否侵犯血管

11、、有無衛(wèi)星灶和包膜等臨床特征的相關(guān)性。
　　 （三）利用組織芯片分析miR-370與肝癌患者生存期的相關(guān)性
　　 利用原位雜交技術(shù)檢測(cè)包含50對(duì)人肝癌組織及癌旁組織的組織芯片中miR-370的表達(dá)情況。按肝癌組織中miR-370表達(dá)的中位數(shù)將50個(gè)HCC病人分為miR-370高表達(dá)組和miR-370低表達(dá)組。利用Kaplan-Meier生存分析法分析miR-370表達(dá)高低與HCC病人生存期長(zhǎng)短的相關(guān)性。
　　 四

12、、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。方差齊性兩樣本資料采用兩樣本雙尾T檢驗(yàn);方差不齊的不配對(duì)資料采用Mann-Whitney U檢驗(yàn);四格表資料采用x2檢驗(yàn);生存分析采用Kaplan-Meier分析;生存曲線采用log-rank檢驗(yàn);P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 [實(shí)驗(yàn)結(jié)果]
　　 一、miR-370在肝腫瘤細(xì)胞株及肝癌組織中表達(dá)顯著下降
　　 （一）肝腫瘤細(xì)胞株中m

13、iR-370表達(dá)顯著下調(diào)
　　 Real-time PCR結(jié)果顯示與人肝細(xì)胞株(IMH)相比，miR-370在肝腫瘤細(xì)胞株Hep3B、 HepG2、 Huh7、MHCC-LM3、PLC/PRF/5、YY-8103、MHCC-97H、SMMC-7721、QGY-7703、Focus、SK-Hep-1中表達(dá)均顯著下調(diào)(P＜0.05)。
　　 （二）DEN大鼠模型肝組織中miR-370表達(dá)顯著下調(diào)
　　 Real-ti

14、me PCR結(jié)果顯示與正常大鼠肝組織相比，miR-370在DEN大鼠模型肝組織中表達(dá)顯著下調(diào)。比較5對(duì)DEN大鼠肝癌組織與癌旁組織miR-370表達(dá)，結(jié)果顯示80％(4/5)的肝癌組織較癌旁組織中miR-370表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05)。
　　 （三）人肝癌標(biāo)本中miR-370表達(dá)顯著下調(diào)
　　 Real-time PCR結(jié)果顯示miR-370在90％(18/20)的肝癌標(biāo)本中表達(dá)下調(diào)，其中80％(16/20)下調(diào)超過

15、50％（肝癌組織/癌旁組織＜50％）。
　　 二、miR-370抑制肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為
　　 （一）miR-370抑制肝癌細(xì)胞增殖能力
　　 miR-370 mimic可顯著抑制肝癌細(xì)胞株MHCC-97H、YY-8103、PLC/PRF/5的增殖能力。反之，miR-370 inhibitor可顯著促進(jìn)MHCC-97H和PLC/PRF/5的增殖能力。
　　 （二）miR-370抑制肝癌細(xì)胞克隆形成能力<

16、br>　　 克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示上調(diào)miR-370表達(dá)可顯著抑制PLC/PRF/5、 YY-8103、MHCC-97H細(xì)胞的克隆形成能力，抑制率分別為55％(P=0.004)、33.0％(P=0.036)、62.7％(P=0.004)。
　　 三、miR-370的表達(dá)與肝癌患者臨床惡性表型和預(yù)后密切相關(guān)
　　 （一）正常肝組織、癌旁組織和肝癌組織中miR-370表達(dá)逐漸降低
　　 Real-time PCR結(jié)果

17、顯示與人正常肝組織相比，miR-370在癌旁組織中表達(dá)顯著下調(diào)，并在肝癌組織中進(jìn)一步下調(diào)。在檢測(cè)的86對(duì)肝癌組織和癌旁組織中，56％(48/86)的HCC組織miR-370表達(dá)較癌旁組織顯著下調(diào)，24％(20/86)無明顯差異，20％(18/86)表達(dá)升高。
　　 （二）miR-370低表達(dá)與肝癌臨床惡性表型密切相關(guān)
　　 通過對(duì)86對(duì)HCC標(biāo)本臨床資料的分析，我們發(fā)現(xiàn)miR-370表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期、是否侵犯血

18、管、腫瘤是否有微衛(wèi)星灶和包膜等肝癌進(jìn)展性臨床相關(guān)指標(biāo)密切相關(guān)。
　　 （三）miR-370低表達(dá)與肝癌總體生存期密切相關(guān)
　　 Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，miR-370低表達(dá)的HCC患者總體生存期較短，miR-370高表達(dá)者總體生存期較長(zhǎng)。
　　 [結(jié)論]
　　 1.miR-370在肝腫瘤細(xì)胞株、大鼠DEN模型肝組織和人肝癌標(biāo)本中表達(dá)下降。
　　 2.miR-370抑制肝癌細(xì)胞增殖