致病性地霉的分子生物學鑒定.pdf

1、目的:臨床上致病性地霉有林生地霉和白地霉等,林生地霉(Geotrichum silvicola)為新近發(fā)現(xiàn)的一種罕見地霉,首次從巴西果蠅和印度柞蠶幼蟲身上分離出來[1]。2002年,我科從一例膿癬患兒的皮損中分離得到一株林生地霉,首次證實該菌可以感染人類[2]。2005年,我科又自一例中毒性表皮壞死松解癥患者的血液中分離出一株林生地霉[3],2006年黃文明[4]等從足部潰瘍中再次分離處一株林生地霉,說明本菌既能引起皮膚地霉病,也可導致

2、系統(tǒng)性感染。白地霉(Geotrichum candidum)是地霉屬的經典代表菌種,白地霉引起的感染可侵犯呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、耳、關節(jié)及皮膚。但以支氣管感染最多見,偶可致全身播散性感染。2007年Sfakianakis等[5]報道了1例由白地霉所致皮膚地霉病,同年我國鐘華等[6]報告了1例先天性免疫缺陷病合并播散性馬爾尼非青霉、白念珠菌及白地霉感染的病例,2008年李秀麗[7]等首次報道了白地霉引起陰道炎兩例。有關林生地霉的形

3、態(tài)學、致病性、動物試驗、營養(yǎng)生理學等各方面均已作了研究[8-9][2-4]。而白地霉目前研究大多集中在其菌體蛋白的開發(fā)利用上,對其臨床致病性研究相對較少,鑒定仍依賴于表型特征。因此我們將從分子生物學鑒定方面對致病性地霉菌做進一步研究。
　　 近年來,隨著科技的發(fā)展,分子生物學技術已被廣泛的運用于真菌的實驗室診斷,而且被證明是真菌分類的有效方法[10]。任意引物聚合酶鏈反應(AP-PCR)是1990年分別在不同的實驗室同時發(fā)展起來

4、的,已在真菌分類鑒定和分型研究方面顯示出巨大潛力,Liu等[11]用AP-PCR法進行真菌鑒定。本研究采用任意引物聚合酶鏈反應(AP-PCR)對林生地霉皮損株、血液株和白地霉進行分子生物學方面的鑒定,從而對不同菌種間的親緣關系作相似性分析,同一菌種不同部位的菌株做多態(tài)性分析,為臨床提供種間及種內鑒定的簡單、快速、可靠的方法。為探討病原微生物的傳染源、傳播途徑以及流行病學調查等提供依據(jù)。從而有利于臨床早期診斷和指導用藥。
　　 方

5、法:林生地霉皮損株與血液株為河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院真菌室保存,均由中國科學院微生物研究所鑒定。白地霉標準菌株購自中國科學院微生物研究所菌種保藏中心。均經過復蘇培養(yǎng)及形態(tài)學和生化鑒定。用E.Z.N.A.Yeast DNA Kit提取地霉菌基因組DNA,采用任意引物AP3、ATG、RP2、OPA-10、S034、S040、S101、S167、S368對臨床上致病性白地霉、林生地霉皮損株和血液株的基因組DNA進行擴增,對各病原菌的DNA指紋的特

6、征進行分析。
　　 結果:成功提取了地霉菌的基因組DNA,其純度和濃度均能滿足PCR反應的要求。地霉的種間鑒定結果顯示,用九種不同引物擴增,不同菌種間可以擴增出大小、數(shù)目不一的DNA條帶,尤其是使用引物S040、S167、S368、AP3、OPA-10和RP2擴增產生的DNA帶型種間差異較明顯。不同種真菌的DNA經擴增后顯示不同的DNA帶型,且同一模板在多次實驗中均產生一致的DNA帶型,而且不同次提取的同種不同株真菌的DNA經擴

7、增后顯示的主要DNA帶型也是相同的。分離自不同感染部位的林生地霉用隨機引物S0034、S040和S368擴增后主要DNA帶型有明顯差異。而S167、AP3、ATG和RP2擴增的條帶多態(tài)性均不明顯,DNA帶型基本一致。
　　 結論:(1)采用E.Z.N.A.Yeast DNA Kit提取的地霉菌基因組DNA可以用于PCR反應。(2)以AP3、ATG、RP2、OPA-10、S034、S040、S101、S167、S368為引物,用A

8、P-PCR可對臨床致病性地霉從基因分子水平上進行鑒定。AP-PCR可作為鑒定致病性地霉簡單、快速、可靠的方法。(3)任意引物S040、S167、S368、AP3、OPA-10、RP2擴增的條帶多態(tài)性都比較明顯,能把白地霉和林生地霉較好的區(qū)別開來。(4)對于林生地霉種內鑒定(皮損株和血液株),任意引物S034、S040和S368擴增的條帶多態(tài)性比較明顯,DNA帶型有明顯不一致,而引物S167、AP3、ATG和RP2擴增的DNA帶型基本一致